李英奇,梁雅旭,高霄霄,万珍,张国敏,2,王锋*

(1.南京农业大学江苏省家畜胚胎工程实验室,江苏 南京 210095;2.南京农业大学动物医学院,江苏 南京 210095)

湖羊作为中国特有的畜禽品种,有肉质鲜嫩、耐粗饲和繁殖能力强等特点。目前湖羊的养殖规模逐步扩大,市场对湖羊的需求量逐年上升,湖羊养殖拥有良好市场前景[1]。在现代化集约饲养条件下,为使动物有更好的生产性能,生产者会提高日粮能量水平,但这可能会打破湖羊肝脏的能量平衡,导致机体出现代谢紊乱。

日粮能量水平通过影响动物的采食量,进而影响体内营养物质的转化和代谢[2]。适宜的日粮能量水平能够保证动物机体健康生长及其生产性能[3]。肝脏作为关键的代谢器官,调控动物机体的能量代谢和脂代谢,若动物摄入能量水平过高,脂肪的合成速度大于其转运速度及氧化消耗,将造成肝脏脂肪沉积,导致代谢紊乱[4]。肝脏的代谢能与相关基因的表达密切相关。AMP激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)对动物机体的能量稳态调控具有重要作用[5]。肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1)作为AMPK的上游激酶,通过促进AMPK磷酸化进而激活AMPK的表达,对调控动物机体的能量水平具有重要意义[6]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通过影响细胞能量状态,参与动物机体的能量代谢。研究表明,当动物机体摄入能量不足时,细胞会启动抑制mTOR活性的信号通路[7]。Chalkiadaki等[8]在饲喂小鼠高脂日粮时,发现沉默信息调节因子1(slient information regulator 1,SIRT1)的活性和表达量显著降低,小鼠出现代谢紊乱。Verheggen等[9]在研究日粮能量水平与脂肪沉积的关系时发现,肝脏脂肪组织的减少与能量摄入的减少显著相关。Mantha等[10]研究发现,在高能日粮饲喂条件下,小鼠能量摄入的增加使肝脏中甘油三酯的合成量增多,造成肝脏的脂质沉积。Foretz等[11]研究发现,在分离的肝细胞中过表达固醇调节元件结合蛋白1c(sterol regulatory element binding protein 1c,SREBP-1c),有利于增强脂肪酸合成基因的表达。以上研究表明,日粮能量水平的变化对动物机体营养物质代谢相关基因的表达有显著影响,但日粮中能量水平对湖羊肝脏能量和脂代谢的影响鲜有报道。本试验以3月龄湖羊公羔为研究对象,探究早期高能饲喂对湖羊肝脏组织中细胞增殖、能量和脂代谢相关基因与蛋白表达的影响,为湖羊的科学饲养提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物和日粮组成

试验于江苏省启东瑞鹏羊业有限公司进行。选取36只体况良好、体重相近(约27.6 kg)和遗传背景相似的3月龄湖羊公羔,预饲期14 d,正式期60 d。所有羊均采用分栏饲养,保证羊舍的干净卫生。将试验羊随机分为2组:正常日粮组(CON)和高能日粮组(HE),每组3个重复,每个重复6只个体。试验日粮配制参考《肉羊饲养标准:NY/T 816—2004》。日粮组成及营养组成水平见表1。

表1 日粮组成及营养组成(干重)Table 1 Diet composition and nutritional composition(Dry weight basis) %

1.2 样品采集与处理

从每个试验重复中随机挑选3只羊屠宰,屠宰前禁食12 h。屠宰后立刻采集肝脏组织样品,一部分置于4%多聚甲醛中固定,经石蜡包埋后用于H&E染色和免疫组化检测;另一部分置于液氮中,用于RNA和蛋白提取。

1.3 RT-qPCR

使用Invitrogen公司的Trizol试剂盒提取肝脏组织样品RNA,再用TaKaRa公司的反转录试剂盒对提取的RNA进行反转录(RT)。用NCBI的Primer Blast设计目的基因引物,送至南京擎科生物技术有限公司合成。RT-qPCR反应体系:SYBR Green Master 10 μL,上、下游引物各0.6 μL,cDNA 1 μL,超纯水 8.4 μL。反应条件:95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共40个循环;72 ℃ 10 min。本试验相关引物序列见表2。

表2 本试验中RT-qPCR的引物序列信息Table 2 RT-qPCR primer sequence information in this study

1.4 肝脏组织切片的H&E染色和免疫组化检测

H&E染色:多聚甲醛固定的肝脏组织经石蜡包埋后进行组织切片(6 μm)。切片经脱蜡、水化后,进行H&E染色,染色结束后用中性树胶封片,显微镜下观察并拍照。

免疫组化检测:参考安世钰等[12]的免疫组化检测方法进行目的蛋白定位研究。步骤简要如下:肝脏组织切片经脱蜡水化处理,抗原修复10 min后自然冷却至室温。用3%甲醇-过氧化氢阻断内源性过氧化物酶后,室温封闭1 h,加一抗4 ℃过夜孵育。经杜氏磷酸缓冲液洗涤后,加二抗室温孵育2 h。二氨基联苯胺显色液处理切片后,苏木素复染,脱水透明处理后封片、镜检。试验所用抗体信息见表3。

表3 本试验中抗体相关信息Table 3 Details of primary antibody in this study

1.5 Western blot检测

参考蔡玉等[13]的Western blot试验步骤进行目的蛋白差异表达检测。步骤如下:取适量肝脏组织与蛋白裂解液混合匀浆后,离心取上清液。用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度后进行蛋白变性处理。向预置胶梳孔中加入20 μL的变性蛋白样品和标品,在200 V电压下电泳35 min;转膜后置于5%的脱脂奶粉溶液中封闭2 h,加一抗后4 ℃过夜孵育,加二抗室温孵育1 h。将膜置于显影液中显影,拍照后使用ImageJ软件对结果进行分析。试验所用抗体信息见表3。

1.6 统计分析

2 结果与分析

2.1 不同能量饲喂水平对湖羊肝脏组织形态结构的影响

正常饲喂组试验羊自由采食量为(1.98±0.4)kg·d-1,屠宰前体重为41.7 kg;高能饲喂组试验羊自由采食量为(1.61±0.1)kg·d-1,屠宰前体重为42.7 kg,高能饲喂组湖羊的日均采食量显著低于正常饲喂组(P<0.05)。正常日粮组和高能饲喂组湖羊的肝脏相对质量分别为(1.90±0.07)%和(1.94±0.06)%。

肝脏H&E染色结果如图1所示:正常饲粮组中湖羊肝脏细胞大小正常,胞质均匀,结构致密完整,可见排列整齐的肝索、正常的中央静脉;高能饲粮组湖羊肝脏组织出现轻度空泡样变性。

图1 不同日粮能量水平湖羊肝脏组织H&E染色结果Fig.1 H&E staining results of liver tissue of Hu sheep with different dietary energy levels 箭头表示存在于肝细胞的轻度空泡。Arrows indicate mild vacuoles in liver cells. 方框表示下图放大的地方。The boxes represent the enlarged area in the figure below. CON:正常饲喂组Control group;HE:高能饲喂组High energy group. 下同The same below.

2.2 不同能量饲喂水平对湖羊肝脏组织细胞增殖、能量和脂代谢相关基因表达的影响

如图2所示:高能饲粮组湖羊肝脏组织中PCNA、SREBP-1c、LXRα和APOB基因mRNA表达水平显著高于正常饲粮组(P<0.05),LKB1和AMPK基因mRNA表达水平显著低于正常饲喂组(P<0.05)。

图2 不同能量饲喂水平的湖羊肝脏组织细胞增殖、能量和脂代谢相关基因mRNA的表达变化Fig.2 Changes in mRNA expression of genes related to cell proliferation,energy and lipid metabolism in liver tissue of Hu sheep’s fed with different energy levels*P<0.05. The same below.

2.3 不同能量饲喂水平对湖羊肝脏组织细胞增殖、能量和脂代谢相关蛋白表达的影响

如图3所示:高能饲喂组湖羊肝脏组织PCNA和SREBP-1c蛋白的表达水平显著高于正常饲粮组(P<0.05),LKB1、AMPK、PGC-1α和SIRT1蛋白的表达水平显著低于正常饲粮组(P<0.05)。

图3 不同能量饲喂水平的湖羊肝脏组织细胞增殖、能量和脂代谢相关蛋白的表达变化Fig.3 Changes in the expression of proteins related to cell proliferation,energy and lipid metabolism in liver tissue of Hu sheep fed with different energy levels

2.4 不同能量饲喂水平对湖羊肝脏组织细胞增殖、能量代谢和脂代谢相关蛋白定位的影响

如图4所示:PCNA蛋白主要表达于湖羊肝细胞核中,在正常饲粮组肝小叶连接处染色较深。mTOR和LXRα蛋白主要表达于肝细胞质中。在阴性对照中,无目的蛋白着色。

图4 免疫组化检测PCNA、mTOR和LXRα蛋白在不同能量水平日粮湖羊肝脏组织中的定位Fig.4 Immunohistochemical detection the localization of PCNA,mTOR and LXRα proteins in the liver tissue of Hu sheep with different dietary energy levels白色箭头处为肝小叶连接处,黑色箭头为染色细胞核。hc:肝细胞;cv:中央静脉。The white arrow is the junction of liver lobules,the black arrow is the stained nucleus. hc:Hepatocytes;cv:Central vein.

3 讨论

3.1 高能饲粮对湖羊肝脏中细胞增殖相关基因的影响

细胞增殖代表着动物机体新陈代谢的进行,在生理稳态和适应能量应激中发挥重要作用[14]。赵健楠等[15]发现3周龄北京鸭的肝脏质量随着日粮能量水平的提高显著增加。张冬梅[16]对蒙古羔羊进行能量限饲试验后发现,低能量组肝脏质量显著低于对照组。Lu等[17]发现降低日粮采食量(降低40%)会降低大鼠肝脏组织中细胞的增殖能力,使S期细胞的数量显著提高。PCNA是一种广泛存在于增殖细胞中的蛋白。在本试验中,高能组湖羊肝脏组织中PCNA的mRNA和蛋白表达水平显著提高,说明高能饲粮可能促进了肝脏组织细胞增殖活动,但在肝脏质量上,未出现显著的变化。

3.2 高能饲粮对湖羊肝脏中能量代谢相关基因表达的影响

LKB1-AMPK-mTOR通路参与动物机体能量代谢。AMPK作为一种“能量感受器”,当动物机体能量摄入增多时,AMPK表达受到抑制,机体内ATP生成减少,ATP的合成代谢增强,肝脏对脂肪酸的氧化利用程度也会降低,进而维持动物机体的能量平衡。LKB1为AMPK的上游激酶,激活AMPK则抑制mTOR信号通路,参与动物机体的能量代谢[18]。本试验发现,与正常饲粮组相比,高能饲粮组湖羊肝脏组织中LKB1与AMPK表达量均显著降低,这与饶敏腊等[19]研究结果一致,表明日粮能量水平的变化与LKB1及AMPK表达量密切相关。Fujii等[20]发现mTOR的作用与动物机体所摄入的能量相关,若营养物质充足,则促进细胞的发育;若营养物质不足,细胞则转向能量恢复的过程,但在本研究中高能饲粮组mTOR表达量较正常饲喂组没有显著变化。

PGC-1α和FoxO1是最常见的SIRT1互作蛋白,在动物机体生理功能的调控方面发挥重要作用。本试验中,高能饲粮饲喂后湖羊肝脏组织中的SIRT1表达量有下降的趋势,这与前人研究结果一致[21]。高能饲喂后导致NAD+活性水平降低,进而降低了SIRT1活性。在高脂应激条件下,FoxO1活性受多种信号转导途径调节,转录后修饰可激活或抑制FoxO1活性[22]。但在本试验中,FoxO1表达量并无显著变化。PGC-1α作为能量代谢重要的调控因子,在面对外界刺激以及不同营养信号时,能结合不同的转录因子来实现动物机体的能量平衡稳态。相关研究表明,动物机体由进食状态转为禁食状态后,为适应营养水平的降低,肝脏的代谢发生变化,同时PGC-1α的表达量显著升高[23]。在本试验中,高能饲粮组湖羊肝脏组织中的PGC-1α蛋白表达量显著降低,表明高能饲粮饲喂后湖羊肝脏的能量代谢水平发生变化。

3.3 高能饲粮对湖羊肝脏组织中脂代谢相关基因表达的影响

肝脏是动物机体调节脂代谢的重要器官,通过调控脂代谢相关蛋白的表达来调控肝脂质库的流入和流出,维持动物机体内的脂质稳态[24]。SREBP-1c作为调节肝脏脂代谢过程的关键基因,其表达水平过高将促进动物肝脏脂质的沉积,导致肝脏代谢紊乱。激活LXR可以通过影响SREBP-1c及其他产脂基因,直接或间接调控肝脏内的脂肪酸及TG合成,引起肝脏内新生脂肪增多[25]。成细华等[26]发现高脂日粮能够上调小鼠肝脏中SREBP-1c的表达;药物干预(治疗)后,小鼠肝脏中SREBP-1c表达水平降低,肝脏组织脂肪变性程度减轻,这表明调控肝脏脂肪合成基因的表达与肝脏脂肪沉积量密切相关。本试验中,高能饲粮组湖羊肝脏组织中LXRα和SREBP-1cmRNA表达水平均显著上升,同时SREBP-1c蛋白表达水平显著提高。黄英等[27]发现,提高日粮能量水平能够促进SREBP-1c的表达,本研究结果与其一致。

肝脏内的脂肪酸水平也受到脂肪酸β氧化的影响。ACADL作为肝脏脂肪酸β氧化的关键酶,其表达量与肝脏脂肪变性相关。王江[28]发现牦牛处于饥饿状态时,其肝脏ACADLmRNA表达水平提高。本试验中,高能饲粮并没有引起ACADLmRNA表达量的变化,表明适当的高能饲粮没有显著改变脂肪酸氧化。ApoB基因在肝脏脂代谢中发挥重要作用,它能促使极低密度脂蛋白增多及体积变大[29]。在本试验中,高能饲粮饲喂后,ApoBmRNA表达量显著上升,这与葛晓可等[30]对肉鸡的研究一致,表明日粮能量水平的提高促进了ApoB的表达。当动物机体摄入的能量水平增加时,肝脏会作出相应反馈,通过增强ApoB等转运蛋白的表达量使脂质转移到肝脏外。

综上所述,提高湖羊的日粮能量水平,会改变湖羊肝脏组织的形态结构、能量和脂代谢相关基因的表达变化,能量和脂代谢相关基因的适应性变化能缓解高能饲粮引起的能量失衡,利于湖羊生长。