王丹琪,张皓,王鹏,张绍铃,吴巨友

(南京农业大学园艺学院/江苏省梨工程研究中心,江苏 南京 210095)

在高等植物的生长发育中,糖既是营养物质又是信号分子[1]。模式植物拟南芥中已鉴定出14个单糖转运蛋白(sugar transporter protein,STP)基因,STP的主要作用是转运质外体的己糖[2]。其中,AtSTP1是一种高亲和力的单糖转运体,能够运输除果糖外的己糖[3],参与了保卫细胞的单糖转运[4]。AtSTP2是花粉特有的高亲和力的己糖转运体,主要负责在花粉成熟早期阶段吸收胼胝质降解产生的葡萄糖[5]。AtSTP4也是高亲和力的己糖转运体,主要在根尖、花粉管和叶片中表达,当受到机械损伤或病原菌侵染时其表达量明显上升[6]。另外3个己糖转运蛋白基因AtSTP6、AtSTP9和AtSTP11在花粉发育的不同阶段中也有表达[7-9]。AtSTP6在花粉外壁形成和花粉粒完全发育阶段表达[7],AtSTP9是目前已知唯一的葡萄糖特异单糖转运体[8],AtSTP11是花粉管特异表达的单糖转运体[9]。AtSTP13也是高亲和力己糖转运体,该基因在花瓣维管组织中特异表达[10]。此外,在苹果还发现MdSTP13a在山梨醇调控花粉管生长的过程中同时吸收己糖和蔗糖,以促进苹果花粉管的生长[11]。

梨(Pyrusbretschneideri)属于蔷薇科果树,分布区域广,具有重要的经济和营养价值。糖既是果实重要的品质因子,也可以作为信号分子调控花粉管生长等发育过程,但是目前糖调控梨花粉管生长的信号转导机制尚不清楚。随着测序技术的迅速发展,‘砀山酥梨’的全基因组测序已顺利完成[12],这为在全基因组水平上研究基因功能提供了条件。本研究基于已公布的梨全基因组数据,筛选出梨STP基因,并通过生物信息学分析以及定量分析研究梨STP基因在各组织和花粉不同发育阶段的表达情况,阐述其蛋白的基本特性;分析梨PbrSTP11蛋白的亚细胞定位,利用反义寡聚脱氧核苷酸(as-ODN)技术抑制PbrSTP11基因表达,验证其在花粉管生长发育中的作用,为探明糖分进入梨花粉管的转运机制和调控生长的功能特性奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试梨品种为‘砀山酥梨’,种植于江苏省徐州市丰县果树试验园。2018年3月,采集梨的根、茎、叶、果实、花粉和花柱,其中花粉采自大蕾期的梨花,收集花药,室温自然散粉后放于硫酸纸袋,埋于硅胶保持干燥,放置于-20 ℃保存,取下的花柱保存于-80 ℃备用。

1.2 花粉离体培养

将梨花粉从冰箱中取出,先在4 ℃解冻2 h,然后在室温(25 ℃)环境下解冻2 h。将花粉加入液体培养基,在黑暗、25 ℃条件下振荡培养。液体培养基为:5 mmol·L-1MES、440 mmol·L-1蔗糖、0.55 mmol·L-1Ca(NO3)2、1.60 mmol·L-1MgSO4、1.60 mmol·L-1H3BO3、1.00 mmol·L-1KNO3,溶解于蒸馏水后用0.1 mol·L-1Tris溶液调pH值至6.5。

1.3 梨STP基因家族筛选

从拟南芥在线信息资源库(http://www.arabidopsis.org)下载14个STP蛋白序列作为参考序列,基于拟南芥STP基因家族的保守结构域在Pfam数据库(http://pfam.xfam.org)的Pfam号(PF00083),进行Hidden Markov Model搜索,将所有收集到的候选STP基因家族序列在InterProScan5数据库(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/)中进行功能域注释,剔除不含STP保守结构域的蛋白序列。最终将筛出的序列进行MUSCLE比对,利用MEGA7.0软件基于邻接法对梨中已筛出的蛋白与拟南芥14个STP蛋白一起构建系统发育树,Bootstrap值设置为1 000。梨的基因组资源从网站(http://peargenome.njau.edu.cn)获得。

1.4 梨STP基因家族生物信息学分析

利用GSDS 2.0网站(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)绘制基因结构。通过MEME 5.0.4(http://meme-suite.org/)识别STP基因的保守蛋白基序,具体设置参数如下:motif个数15;最小motif宽度10个氨基酸;最大motif宽度100个氨基酸。通过梨全基因组数据获得已筛出的STP家族基因在染色体上的位置。利用Protparam软件(http://web.expasy.org/protparam/)进行氨基酸数、相对分子质量、脂肪族氨基酸指数、理论等电点和蛋白质疏水性的分析。亚细胞定位利用CELLO v.2.5(http://cello.life.nctu.edu.tw/cgi/main.cgi)进行预测。

1.5 梨STP基因定量表达分析

使用多糖多酚植物RNA提取试剂盒(成都福际生物技术有限公司)提取RNA,采用反转录试剂盒Transgene(TransScript Reverse Transcriptase,AT101-02)合成cDNA,使用RT-qPCR法分析PbrSTP基因的表达。设计目的基因特异引物,并使用NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)的Primer-blast工具检测引物的特异性。以PbrUBQ为内参基因,采用2-ΔΔCT法计算出目的基因相对表达量。RT-qPCR分析引物见表1。采用Excel 2007软件绘制图表和统计分析。结果均以3次重复的平均值±标准差表示。

表1 试验所需引物及用途Table 1 Primers needed in the experiment and its application

1.6 不同糖种类和不同糖质量浓度的处理

在梨花粉离体培养试验中,设置3种糖(蔗糖、葡萄糖和果糖)和不同糖质量浓度(0、50、100、150、200 g·L-1)的液体培养基培养花粉。这3种糖为培养基中支持花粉管生长的唯一碳源,以探究不同糖和不同糖质量浓度对梨花粉萌发及生长的影响。处理后,在梨花粉培养2 h时进行拍照,以统计花粉的萌发率;当梨花粉培养4 h进行拍照,以统计花粉管的长度。本试验使用配备有CCD照相机的DP80(奥林巴斯,日本)的Olympus IX73显微镜进行拍照。利用Image J软件(https://imagej.nih.gov/ij)统计花粉萌发率和花粉管长度。此外,所有处理花粉收集后提取总RNA,利用荧光定量PCR检测目的基因表达量。

1.7 PbrSTP11基因表达分析、基因克隆与蛋白亚细胞定位

为了验证梨花粉中STP蛋白的潜在功能,以不同发育阶段‘砀山酥梨’花粉的转录组数据[13]为基础,对35个PbrSTP基因进行表达分析。

对花粉高表达的PbrSTP11进行基因克隆和亚细胞定位试验。以‘砀山酥梨’花粉cDNA为模板用高保真聚合酶Phanta®Max Super-Fidelity DNA Polymerase(Vazyme,P505)对PbrSTP11基因全长序列进行PCR扩增。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,切取目的条带,按DNA回收试剂盒(江苏康为世纪生物科技有限公司)说明书回收纯化目的片段DNA。对p1300-35S-GFP载体质粒(TaKaRa)用XbaⅠ和BamHⅠ内切酶进行酶切。载体质粒酶切纯化后,用重组连接酶(Vazyme)将目的基因和载体的酶切产物在37 ℃条件下连接0.5 h,转化构建载体。测序准确构建载体成功后,将PbrSTP11的质粒转入农杆菌(GV3101)中,并在28 ℃培养箱中培养48 h。采用张皓等[14]的方法侵染烟草:将农杆菌液按体积比1∶50的比例扩繁后5 000 r·min-1离心10 min收集菌液,并将菌液悬浮在含有10 mmol·L-1MES、10 mmol·L-1MgCl2和100 μmol·L-1乙酰丁香酮的诱导剂中,置于室温50 r·min-1的摇床中孵育4 h;用1 mL去针头无菌注射器吸入菌液缓缓注射到小叶本氏烟草的叶片背面,侵染完成后放在20～25 ℃的环境下继续生长2 d,并使用ZEISS LSM800激光共聚焦显微镜拍照。试验重复3次。亚细胞定位引物见表1。

1.8 酵母功能验证

酵母感受态的制备与转化参照具体操作参照Clontech操作指南(Clontech Laboratories Inc.,USA)。将测序正确的PbrSTP11构建到酵母表达载体pYES 2.0上,并分别转入糖转运蛋白敲除的酿酒酵母突变体EBY.VW 4000(仅对麦芽糖有吸收能力)中。酵母转化菌株在不同糖含量培养基上生长,以空载体pYES 2.0作为对照,调整SD/-Ura固体培养基中单糖底物质量浓度为2 g·L-1,研究梨单糖转运蛋白对葡萄糖、果糖、蔗糖和山梨醇4种单糖的转运能力及特殊性。具体操作如下:1)将转化了梨PbrSTP基因的酵母菌株接种至5 mL SD/-Ura/麦芽糖液体培养基中,28 ℃、200 r·min-1摇菌,培养至D600值达到0.6左右;2)取1.5 mL酵母菌液置于2 mL离心管中,3 000g离心5 min后弃上清液,再加入1.5 mL的1×PBS缓冲液,4 000g离心5 min,重复3次;3)调整菌液D600至1.0,并按1∶10、1∶100和1∶1 000的体积比稀释菌液;4)吸取原液和各稀释液各5 μL至SD/-Ura/麦芽糖、SD/-Ura/葡萄糖、SD/-Ura/果糖、SD/-Ura/蔗糖、SD/-Ura/山梨醇固体培养基上,在28 ℃下倒置培养3～5 d后观察菌落生长情况。

1.9 反义寡聚脱氧核苷酸(as-ODN)技术处理

as-ODN引物序列的长度为17～22 bp,GC含量为60%～65%,以保证合适的解链温度。每个基因设计5条as-ODN序列,以不与基因组任何序列完全互补的正义寡聚脱氧核苷酸(sense oligo nucleotide,s-ODN)序列为对照。首先将花粉在液体培养基中培养40 min,取200 μL至离心管中,用合成好的as-ODN序列按5、10、20、30、40 mmol·L-1浓度梯度加入转染试剂并在25 ℃培养箱中孵育15 min,转染试剂终质量浓度为15 μg·mL-1,然后加入梨花粉培养基中培养2 h后,取样观察并统计。收集处理后的花粉并提取RNA,利用荧光定量PCR检测目的基因表达量,筛选出效果最佳的as-ODN引物序列(表1),并通过观察花粉管生长情况,筛选出最佳引物浓度。

2 结果与分析

2.1 梨STP基因家族鉴定及基本信息分析

通过对梨基因组数据的筛选,最终获得35个STP基因,分别命名为PbrSTP1—PbrSTP35,其基本信息如表2所示。根据梨染色体基因组信息,分析35个STP基因在染色体上的分布情况,发现有32个基因不均匀地分布在染色体上,3个基因分布在scaffold上。分布基因最多的染色体为Chr16,分布有11个基因;其次是Chr2、Chr12和Chr13,各分布4个;Chr15分布3个,Chr1和Chr5各分布2个,Chr4和Chr8各分布1个。STP蛋白平均长度约为482个氨基酸,其中PbrSTP29最长为602个氨基酸,而PbrSTP3最短为273个氨基酸。

表2 梨STP基因基本信息Table 2 Basic information of STP genes in pear

续表2 Table 2 continued

2.2 梨STP基因家族系统发育关系、基因结构以及蛋白质保守功能域分析

将梨中35个PbrSTP基因与拟南芥中14个AtSTP基因编码的蛋白序列构建系统发育树,结果(图1-A)显示,梨STP基因家族分为5个亚家族,各家族的序列具有高度保守性,大部分序列的同源性达90%以上。梨STP基因CDS序列平均长度为1 536 bp左右,其中PbrSTP13(2 131 bp)基因序列最长,PbrSTP3(819 bp)序列最短。对梨STP的编码区结构进行分析,结果(图1-B)发现STP家族基因的外显子数为 1～8个,其中,PbrSTP29含有8个,而PbrSTP3和PbrSTP4只有1个,表明STP基因家族在进化过程中出现了外显子增加或者缺失现象。

对梨STP基因家族成员的蛋白序列分析发现,梨STP蛋白的motif与拟南芥的高度一致,其中 motif 1—motif 11是高度保守的结构(图1-C),绝大多数梨STP基因中均含有这11个motif,进一步说明STP基因在进化过程中的相对保守性。

图1 拟南芥和梨STP基因家族系统发育关系(A)、基因结构(B)及蛋白motif分析(C)Fig.1 Phylogenetic relationship(A),gene structure(B)and protein motif analysis(C)of STP genes family in Arabidopsis thaliana and pear

2.3 梨STP基因家族的基本理化性质分析

对35个PbrSTP基因的基本理化性质进行分析,结果(表3)发现PbrSTP蛋白平均相对分子质量为(29.88～65.26)×103;理论等电点(pI)为8.54～9.83,蛋白质呈碱性;不稳定指数为29.22～45.42,脂肪族指数为98.49～114.93;最大疏水系数为0.20～0.64,均为疏水性蛋白(最大疏水系数>0)。另外,利用CELLO v.2.5网站对这些基因的蛋白序列进行亚细胞定位预测分析,发现其均定位于细胞质膜上。

表3 梨STP基因家族基本特性Table 3 Basic characteristics of the STP gene families in pear

2.4 梨PbrSTP基因家族成员表达模式分析

对35个PbrSTP在不同发育阶段‘砀山酥梨’花粉中的表达进行分析,结果发现有17个PbrSTP基因在花粉中没有表达,而其余18个基因的表达如图2所示。PbrSTP9、PbrSTP10、PbrSTP15、PbrSTP16、PbrSTP17、PbrSTP22和PbrSTP26的表达量从水合花粉粒(HP)到停止生长的花粉管(SPT)过程中逐渐降低,而其他STP基因在梨花粉管发育过程中表达趋势并不明显。其中PbrSTP11从HP到正常生长的花粉管(PT)中的表达量比其他PbrSTP基因更高,甚至在SPT中还保持相对较高的表达量,表明其在花粉生长中可能具有重要的功能。

图2 ‘砀山酥梨’花粉STP家族基因表达水平Fig.2 Expression level of STP gene families of‘Dangshansuli’pear pollen MP:花粉粒;HP:水合花粉粒;PT:生长的花粉管;SPT:停止生长的花粉管。红色代表高表达,白色代表低表达。MP:Pollen grain;HP:Hydrated pollen grains;PT:Growing pollen tube;SPT:Stop growing pollen tube. Red indicated low expression and white indicated high expression.

2.5 PbrSTP11基因在不同糖种类和不同质量浓度的培养基中花粉的萌发率以及不同组织中的表达分析

由图3可见:在含蔗糖的培养基中,无论是花粉萌发率还是花粉管长度都显著高于含果糖、葡萄糖或不含糖的培养基。与无糖培养基相比,含糖培养基能够促进花粉萌发,随着糖质量浓度的升高花粉萌发率呈先升高后降低的趋势,高质量浓度(200 g·L-1)的果糖和葡萄糖对花粉萌发抑制明显。与无糖的培养基相比,含糖培养基均能够促进花粉管生长;低质量浓度的果糖和葡萄糖对花粉管生长的促进作用没有蔗糖显著。随着单糖质量浓度的升高,花粉管长度没有明显变化,高质量浓度的单糖显著抑制花粉管生长。

图3 花粉在蔗糖、葡萄糖和果糖培养基中萌发率(A)和花粉管长度(B)Fig.3 Pollen germination rate(A)and the length of pollen tube(B)in the media with sucrose,glucose and fructose不同小写字母表示不同处理间在0.05水平上差异显著,下同。Different letters above each bar indicate significant difference at 0.05 level among different treatments. The same below.

由图4可见:不同质量浓度蔗糖对PbrSTP11表达量有影响但差异不显著;在葡萄糖和果糖的培养基中,随着单糖质量浓度升高,PbrSTP11表达量显著升高,表明高质量浓度的单糖促进PbrSTP11基因表达。此外,通过对PbrSTP11基因在梨的根、茎、叶、果实、子房、花柱和花粉等组织中的RT-qPCR分析,发现PbrSTP11在花粉中表达量高,而在其他组织中几乎不表达。

图4 PbrSTP11基因在不同培养基(A)和组织(B)中的表达分析Fig.4 Expression analysis of PbrSTP11 gene in different medium(A)and tissues(B)

2.6 PbrSTP11蛋白的亚细胞定位和功能分析

如图5所示:绿色荧光蛋白(GFP)空载在烟草叶片的细胞中均有表达;而PbrSTP11的绿色荧光主要定位在细胞膜上,说明PbrSTP11为细胞膜蛋白,这与CELLO v.2.5网站预测结果一致。

图5 PbrSTP11蛋白的亚细胞定位(标尺=20 μm)Fig.5 Subcellular localizations of PbrSTP11 protein(Bars=20 μm)

由图6可见:转化空载pYES 2.0酵母菌株EBY.VW 4000只能在含有麦芽糖的培养基上生长,而在其他碳源培养基上均呈现透明菌斑,但未生长;在含有20 g·L-1葡萄糖的培养基上,转入PbrSTP11基因的酵母菌斑长势很旺,在20 g·L-1果糖的培养基上酵母长势相对于葡萄糖培养基上的长势稍弱,100倍和1 000倍稀释菌液较明显;在含有20 g·L-1蔗糖和20 g·L-1山梨醇的培养基上,未观察到转入PbrSTP11基因的菌斑生长。综上所述,含有PbrSTP11蛋白的酵母菌株对不同糖的吸收能力由大到小依次为:葡萄糖、果糖、蔗糖/山梨醇,表明PbrSTP11蛋白对单糖具有转运能力,但不能转运蔗糖和山梨醇。

图6 PbrSTP11蛋白在酵母突变体EBY.VW 4000中的功能验证Fig.6 Functional verification of PbrSTP11 in yeast mutant EBY.VW 4000酵母菌斑在每种培养基上从左至右分别为稀释1倍、10倍、100倍和1 000倍。Yeast plaques were diluted 1-fold,10-fold,100-fold,and 1 000-fold from left to right on each medium.

图7 敲低PbrSTP11表达抑制梨花粉管生长Fig.7 Knocking-down PbrSTP11 expression inhibited pollen tube growth A. RT-qPCR检测PbrSTP11基因的表达Expression level of PbrSTP11 detected by RT-qPCR;B. as-ODN处理后花粉管长度统计 Statistical analysis of the pollen tube length after as-ODN treatment;C. as-ODN处理对花粉管生长的影响 The effect of as-ODN treatment on the growth of pollen tube.**P<0.01. Bar=200 μm.

由图7可见:as-ODN处理可以显著抑制花粉PbrSTP11的表达,当PbrSTP11表达下调后,花粉管的长度明显变短,表明降低PbrSTP11的表达量抑制了梨花粉管生长。

3 讨论

STP属于单糖转运蛋白家族(monosaccharide transporter,MST)成员,广泛存在于植物中[1-2,15]。本研究共鉴定出35个梨STP基因,其特性与已报道的拟南芥STP基因高度相似[1]。通过亚细胞定位软件预测梨PbrSTP均定位在细胞膜上,亚细胞定位试验也表明PbrSTP11定位于细胞膜,这与Zhang等[16]的研究结果一致,表明PbrSTP是一种膜蛋白。

花粉萌发和花粉管生长是植物生殖发育的重要过程[17],但是花粉无法进行光合作用并且是共质体分离,因此在花粉管生长过程中碳水化合物必须从雌蕊周围的组织输入[8-9]。在离体培养中,蔗糖是花粉萌发和生长所必需的,目前已在生长的花粉中鉴定出蔗糖转运体[18-19]。Ylstra等[20]研究发现矮牵牛花粉能将培养基中的蔗糖转化为葡萄糖和果糖,表明花粉细胞壁中具有糖转化酶的活性,同时也表明花粉管可以吸收单糖。因此探讨单糖转运蛋白在花粉萌发和生长中的作用至关重要。本试验利用不同糖种类和浓度培养花粉,发现含蔗糖的培养基中花粉萌发率和生长速率都显著高于含果糖、葡萄糖以及不含糖的培养基。同时,高质量浓度的葡萄糖和果糖抑制了花粉萌发,说明不同糖种类对于梨花粉的萌发和生长调控机制不同,对于其生长发育的稳态调控至关重要。

转录组数据有效评估了拟南芥花粉发育过程中不同STP基因的表达模式,AtSTP2、AtSTP4、AtSTP6、AtSTP9、AtSTP10、AtSTP11在拟南芥花粉发育过程中有表达,其中AtSTP2在小配子体发育早期表达,而AtSTP4、AtSTP6、AtSTP9和AtSTP11则在花粉成熟过程中积累,在萌发花粉和生长花粉管中,AtSTP11的表达最显著,AtSTP4和AtSTP10的表达水平虽低,但也同样显著[2,21-23]。本研究根据梨花粉不同发育时期的转录组数据,发现有18个PbrSTP基因在花粉中表达,其中PbrSTP11(AtSTP11的同源基因)在花粉生长的不同阶段都具有较高的表达水平,同时RT-qPCR也证实了PbrSTP11在花粉中特异性表达,这与AtSTP11只在成熟的花粉和花粉管中表达相一致[9]。通过酵母功能互补试验证实PbrSTP11对葡萄糖、果糖具有转运能力,并且对葡萄糖的转运能力高于果糖,且PbrSTP11没有转运蔗糖和山梨醇的活性,说明PbrSTP11具有转运糖的特异性。为了进一步探究梨PbrSTP11调控花粉生长发育的功能,通过as-ODN技术抑制PbrSTP11基因的表达,发现梨花粉管的生长减慢,可能是由于花粉生长过程中“库”端糖类卸载受阻,同时蔗糖水解产生的果糖和葡萄糖在胞外大量积累,不能有效转运至胞内,从而抑制了花粉管的生长。在含高质量浓度葡萄糖的培养基中培养的花粉生长受到抑制,进一步证实了胞外葡萄糖抑制花粉管生长的特性。因此,PbrSTP11是将花粉胞外的单糖及时转运至胞内的关键蛋白,对梨花粉的正常生长起重要作用。结合本研究结果,下一步将主要探索PbrSTP11的转录调控机制,包括糖信号、生物胁迫以及非生物胁迫等对PbrSTP11蛋白表达的调控,以期为糖分进入梨花粉管的转运机制和调控生长的功能研究提供理论依据。