徐智彬，齐旭刚，莫之准，汤佳航，吴泽宏，许静，姜兴涛，路中华，刘欣安**

（1.广东省脑连接图谱重点实验室，中国科学院脑联结解析与调控重点实验室，深港脑科学创新研究院，中国科学院深圳先进技术研究院脑认知与脑疾病研究所，广东 深圳 518055；中国科学院大学，北京 100049；2.深圳雾芯科技有限公司科学中心，广东 深圳 518101）

吸烟是全球最大的公共卫生威胁之一，中国吸烟人数全球排名第一，因此控制吸烟成瘾刻不容缓。更安全的尼古丁产品如电子烟为消耗尼古丁提供了一种不可燃的方式，为传统烟草替代提供一种可能性。尼古丁是世界上排名第一的成瘾性物质之一，全世界大多数用户（约68%）通过吸烟来消耗尼古丁。尼古丁俗称烟碱，是香烟的主要化学成分及主要致瘾成分，也是目前电子烟产品的主要成分。尼古丁作用于大脑神经系统[1]，令人产生依赖性[2]和戒断困难[3]。尼古丁主要通过结合大脑中的尼古丁乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs）而起作用。目前市场上电子烟的口味多达8 000种，对于含有不同口味添加剂的电子烟产品的安全性及神经效应都有待进一步深入研究。其中市场上运用最广泛的口味添加剂之一是凉味剂WS-23［化学名称为N，2，3-三甲基-2-（1-甲基乙基）丁酰胺或者N，2，3-三甲基-2-异丙基丁酰胺；N，2，3-trimethyl-2-isopropl butanamide］。由 于WS-23可赋予产品清凉的口感，广泛用于食品、饮料、糖果、化妆品、烟制品及医药等领域。凉味剂WS-23作为雾化液气溶胶吸入毒性的研究已有相关报道[4]，同时电子烟作为具有潜在成瘾性的产品，雾化液中的凉味添加剂本身及其与尼古丁混合雾化后形成的气溶胶吸入对成瘾性等精神行为的影响有待深入研究。本项目旨在小鼠动物模型上运用精准的气溶胶雾化给药系统建立长期暴露模型，用于评估不同雾化液成分及其与尼古丁混合后的气溶胶吸入对不同实验动物模型的成瘾性行为，本文特异性地探讨电子烟雾化液中的凉味添加剂WS-23是否对小鼠的气溶胶长期暴露所产生的成瘾性有影响，并为未来的神经精神性机制探讨提供可靠的动物研究模型和评估手段。

1 材料与方法

1.1 实验动物与生物材料

本课题实验动物SPF级C57BL/6J雄性小鼠，8周龄，由北京维通利华实验动物技术有限公司购入。实验动物于经过国家认证的SPF级动物饲养间屏障环境内饲养，屏障内温度与相对湿度范围分别是20～26 ℃、40%～70%，采用12 h∶12 h昼夜间断照明，保证充足的饲料与水自由饮食，本研究方案经过中国科学院深圳先进技术研究院实验动物伦理委员会审议通过，符合实验动物福利伦理规范要求。实验动物伦理审查受理号：SIATIACUC-190221-NS-LXA-A0610。所有小鼠组织取材工作均在经注射氯胺酮（Ketamine，100 mg/kg）和甲苯噻嗪（xylazine，10 mg/kg）麻醉并断颈处死后进行。按照实验需求将小鼠随机分组，共32只，分为4组，每组8只，分组如下：A组：溶剂对照组（Vehicle）；B组：纯WS-23组（WS-23）；C组：纯尼古丁组（Nicotine）；D组：WS-23+尼古丁组（WS-23+Nicotine）。

1.2 试剂与溶液制备

WS-23（N-2，3-三 甲 基-2-异 丙 基 丁 酰胺，CAS No. 51115-67-4）采购于昆山亚香香料股份有限公司（纯度≥99.9%），载体溶剂甘油（vegetable glycerin，VG）和 丙 二 醇（propylene glycol，PG）分别采购于陶氏化学和宝洁公司，尼古丁采购于湖北和诺生物工程股份有限公司（纯度≥99.5%）。

本实验中各气溶胶雾化液的配方如下：空白溶剂对照组电子雾化液的配制：50%PG+50%VG；WS-23组电子雾化液的配制：5%WS-23+45%PG+50%VG；Nicotine组电子雾化液的配制：4%Nicotine+46%PG+50%VG；WS-23+Nicotine组电子雾化液的配制：5%WS-23+4%Nicotine+41%PG+50%VG。

1.3 仪器与暴露程序

InExpose全身烟雾暴露系统：InExpose是一个高度集成的、结构紧凑的、计算机程序控制的吸入暴露系统。有全身性和仅鼻式两种暴露形式，可实现各种气溶胶、毒气和烟雾的吸入暴露。配备有全自动（24支烟）的香烟烟雾发生器和电子烟发生器。体积小，内部容积少，减少研究材料的损耗。可实现4种不同的气体的混合暴露。InExpose全身烟雾暴露系统可全面模拟电子烟暴露，精准定量烟雾中尼古丁等化学物质的含量，同时全身暴露系统避免了口鼻暴露对动物造成的束缚应激，对于烟雾暴露物质成瘾[5]及精神行为的监测的干扰较小[6]（图1）。试验中所用电子雾化器为RELX四代无限电子雾化器（深圳雾芯科技有限公司）。

图1 InExpose全身烟雾暴露系统示意图

将每组每只小鼠放置于SCIREQ全身暴露系统独立卡槽中，按照FlexiWare程序（IX-2PD-4DIOECIG inExpose，表1）固定时间段每天1次，暴露于相应电子雾化液的气溶胶中30 min/次，流速控制在2 L/min，电子烟雾化液由深圳雾芯科技有限公司提供。气溶胶暴露给药连续不间断4周，随后进行行为学测试。

表1 FlexiWare程序参数（IX-2PD-4DIO-ECIG inExpose）

1.4 方法

1.4.1 条件性位置偏好实验

条件性位置偏好实验（Conditioned Place Preference，CPP）基于经典（巴甫洛夫）条件反射原理[7]，操作条件要求简单，通常用于衡量滥用药物的奖励效果[8]。本实验所用条件偏好箱由隔板分成两个箱体，箱体各自的贴纸不同。电子烟暴露造模三周后分析小鼠在条件偏好箱中的本底偏好，重复2天取平均值。之后开始做CPP条件匹配建立，到第5天进行测试。让小鼠自由活动15分钟并进行录像，分析并计算小鼠在A箱体和B箱体停留时间。条件偏好性评分=伴药盒（A 或B）停留的时间/（A + B 盒的停留时间）。

1.4.2 高架十字迷宫实验

高架十字迷宫实验（Elevated plus maze test，EPM）用于测试长期气溶胶暴露小鼠在48小时戒断状态下的焦虑水平[9]，在第4周造模结束后开始高架十字迷宫实验，录像记录小鼠在迷宫内活动轨迹，视频共记录10分钟[10]。

1.4.3 小鼠血液样本采集

小鼠麻醉后从眼眶静脉窦采血；血液静置半小时后，于4 ℃离心机内以2 000 rpm离心15分钟获得的上清液即血清。

1.4.4 慢性气溶胶暴露模型小鼠血清皮质酮水平测定实验

本实验采用小鼠皮质酮（Corticosterone）酶联吸附测定试剂盒，该试剂盒采用竞争法酶联免疫吸附检测技术（ELISA）测定小鼠血清样品中的皮质酮水平。实验动物在戒断后，采血经酶联免疫检测皮质酮含量，数据采用GraphPad Prism 9.0软件制图分析结果。

1.4.5 行为学数据统计与分析

行为学视频采用ANYmaze软件分析得出量化指标，统计采用GraphPad Prism 9.0软件分析并制图，数据以Mean±SEM表示，组间差异以One-way ANOVA检验，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2 结果

2.1 长期气溶胶暴露小鼠模型的成瘾相关行为学检测

2.1.1 条件性位置偏好实验

本实验所用条件偏好箱由隔板分成两个箱体，箱体各自的贴纸不同。实验步骤参考经典的条件性位置偏好行为范式[11]。预测试期结果显示，各分组实验小鼠对两侧箱体无明显偏好，气溶胶暴露造模三周后开始做CPP条件匹配建立，到第5天进行测试（图2）。在造模第3周后开始，经过一周训练即在第4周造模结束后，条件性位置偏好（CPP）实验测试结果显示，跟溶剂对照组比较，纯尼古丁在伴药盒停留时间有延长，但偏爱分数差异无显著性；纯WS-23组及WS-23+尼古丁组小鼠在伴药盒停留时间有降低，偏爱分数差异同样没有显著性差异；跟溶剂对照组相比，各组间偏好分数（CPP score）未见显著性差异；结果如图2所示，纯尼古丁组小鼠对伴药盒内的偏爱分数与溶剂对照组比较差异无显著性（P>0.05）；而纯尼古丁组与纯WS-23组及WS-23+尼古丁组相比，其偏好指数明显增高，有显著差异（P<0.01）。

图2 气溶胶暴露小鼠的条件性位置偏好测试结果

2.1.2 高架十字迷宫实验

在第4周造模结束后，实验小鼠停止烟雾暴露48小时后进行高架十字迷宫检测，录像记录小鼠在迷宫内活动状态。通过分析实验动物在实验区域（开臂与闭臂）的行动轨迹判断小鼠的焦虑状态。图3中的分析结果显示，含WS-23的气溶胶长期暴露小鼠较不含WS-23的小鼠总体的运动距离减少（图3A）。图3B显示，与溶剂对照组或纯尼古丁组相比，含WS-23的气溶胶长期暴露小鼠（包括纯WS-23组及WS-23+尼古丁组）的运动速度也显著下降。与溶剂对照组相比，纯尼古丁组、纯WS-23组及WS-23+尼古丁组小鼠待在开臂的时间无明显差异（图3C）；WS-23+尼古丁组小鼠在闭合臂的运动时间较溶剂及纯尼古丁组显著延长（图3D）。进一步地，WS-23+尼古丁组小鼠与纯尼古丁组相比在开放臂的运动距离显著降低（图3E），而待在开放臂的运动距离百分比无显著差异（图3F）；各组实验小鼠进入开放臂的次数（图3G）和百分比（图3H）均无显著差异。

图3 气溶胶暴露小鼠48小时戒断后高架十字迷宫测试结果

2.2 长期气溶胶暴露小鼠戒断48小时的血清皮质酮含量分析

为了进一步检测实验小鼠的气溶胶暴露戒断后可能的生理反应，本研究检测了小鼠戒断48小时的血清皮质酮含量。在不同雾化液的长期气溶胶暴露的各组实验小鼠经历48小时戒断后，采血经酶联免疫检测皮质酮含量。检测结果如图4显示，不含尼古丁组包括电子烟雾化液溶剂对照组和WS-23组的小鼠戒断后血清皮质酮含量相互间不存在统计学差异；含尼古丁组和不含尼古丁组比，小鼠48小时戒断后血清皮质酮含量都有升高，含尼古丁组包括纯尼古丁组与WS-23+尼古丁组的气溶胶长期暴露小鼠的血清皮质酮含量由于组内差异较大，不存在统计学差异。

图4 长期气溶胶暴露小鼠戒断48小时血清皮质酮浓度

3 讨论

3.1 雾化凉味剂WS-23对小鼠奖赏行为的作用

对电子烟气溶胶的成瘾性评估一直是个难点。尼古丁是电子烟雾化液中的主要致瘾成分。除了尼古丁之外，电子烟雾化液中其他成分如PG/VG，以及常用的添加物如凉味剂WS-23等是否具有成瘾性；这些口味添加剂如何影响尼古丁的成瘾性的研究尚不深入。本研究通过精准的雾化气溶胶暴露仪器InExpose构建小鼠电子烟气溶胶长期慢性暴露模型（每天半个小时，连续4周），并采用条件位置性偏好实验，分析和比较了气溶胶载体溶剂PG/VG、纯尼古丁、纯凉味剂WS-23及凉味尼古丁气溶胶四种不同雾化液的致成瘾性。实验结果表明，在本实验条件即每天短时程气溶胶暴露，即使进行为期1个月的慢性不间断暴露，溶剂及纯尼古丁气溶胶暴露均未诱导实验小鼠产生明显奖赏性偏好行为，尼古丁气溶胶长期暴露的小鼠在CPP测试中只显示一定程度的正性奖赏性偏好，而纯凉味剂以及凉味尼古丁气溶胶暴露小鼠表现出显著的条件位置性厌恶。本研究结果表明，在本实验中的长期、短时程气溶胶暴露条件下，溶剂PG/VG以及纯尼古丁雾化液暴露对小鼠并不产生显著的奖赏作用；而凉味剂WS-23气溶胶和凉味尼古丁气溶胶长期暴露在小鼠模型上未使得实验小鼠产生奖赏性偏好，凉味剂WS-23 及凉味尼古丁气溶胶暴露诱导小鼠的厌恶行为。根据最近的文献报道，WS-23在大鼠的急性及亚急性吸入实验中都未表现出明显的毒性反应[4]，而本实验结果表明实验小鼠对WS-23不仅没有表现出喜好，相反地，对纯凉味剂和含凉味剂的雾化液都表现出场景关联回避行为。Henderson等人曾报道薄荷醇不同异构体对乙酰胆碱受体的上调及多巴胺神经元自发放电具有显著差异[12]，可见不同化学结构的凉味剂对于大脑奖赏系统及气溶胶成瘾性具有复杂的作用。

3.2 凉味剂WS-23对长期气溶胶暴露小鼠的戒断后焦虑行为的影响

高架十字迷宫实验用于测试长期气溶胶暴露小鼠在48小时戒断状态下的焦虑水平，从而间接反映小鼠对气溶胶暴露的成瘾性。在本实验中，通过高架十字迷宫行为检测，比较和分析了在停止气溶胶暴露48小时后，各组小鼠的焦虑水平和运动量。结果提示，凉味尼古丁气溶胶暴露小鼠48小时戒断后未见明显的焦虑样行为；虽然纯凉味剂WS-23及凉味尼古丁气溶胶暴露小鼠的戒断后运动距离和速度显著下降，凉味尼古丁暴露小鼠在闭合臂停留时间显著降低、在开放臂的运动距离显著下降，但纯凉味剂WS-23及凉味尼古丁气溶胶暴露小鼠在开放臂的时间和百分比、进入开放臂的次数和百分比并未有显著性差异，因而未见明显的戒断后焦虑反应。Cooper等人的研究（2021）结果表明，薄荷醇添加剂会增强雄性小鼠的尼古丁气溶胶的自给药行为，提示薄荷醇口味剂可能对尼古丁的成瘾性有增强行为[13]。最近有研究通过大鼠尼古丁自给药系统的结果表明，薄荷醇对尼古丁依赖有影响；在尼古丁较难获取时，薄荷醇可抑制尼古丁依赖性[14]，与本实验结果相比，提示不同凉味剂在尼古丁成瘾的不同给药方式（静脉给药或气溶胶给药；合并摄入或替代摄入）和不同给药阶段（持续给药及戒断）具有不同的神经行为效应。皮质酮含量变化是反映成瘾物质戒断反应的重要生理指标之一[15]，在本实验中，含尼古丁气溶胶暴露的小鼠在停止暴露48小时后，血清检测皮质酮水平都有升高趋势，提示含尼古丁气溶胶在小鼠长期暴露后48小时戒断期可能诱发小鼠生理性戒断反应[16]，但凉味尼古丁组小鼠的戒断后血清皮质酮水平较纯尼古丁组并无明显差异[17]。这些小鼠长期气溶胶暴露研究结果表明，凉味剂WS-23本身不具有奖赏性，而含凉味剂的尼古丁气溶胶暴露小鼠戒断后主要表现为运动下降。

3.3 小结与展望

综合分析，每天半小时的短时程尼古丁气溶胶暴露在一个月持续慢性暴露条件下，尼古丁气溶胶并未诱发实验小鼠明显的奖赏性行为偏好，凉味剂WS-23气溶胶长期暴露不改变实验小鼠的奖赏性行为；相反地，在尼古丁气溶胶中添加凉味剂WS-23的混合雾化液长期暴露将明显降低实验小鼠的奖赏性行为，在气溶胶暴露戒断48小时后未见明显的焦虑行为表征。含尼古丁组（包括纯尼古丁组与含WS-23的凉味尼古丁气溶胶组）长期暴露小鼠的血清皮质酮含量都有升高趋势。基于以上行为学及血清应激激素皮质酮水平检测结果推测，电子雾化液空白溶剂和含凉味剂WS-23（5%）的电子雾化液气溶胶长期暴露未表现出明显的成瘾性，且含WS-23的电子雾化液无促成瘾效果；而含尼古丁（4%）的电子雾化液中添加凉味剂WS-23（5%）显著降低实验小鼠的奖赏性偏好，同时气溶胶暴露戒断48小时后主要表现为运动下降。这些结果提示，电子雾化液成分如凉味剂等口味添加剂与尼古丁混合后对成瘾或焦虑等精神行为可能产生交互作用，其可能的机制有待深入研究。本实验结果表明，不同凉味添加剂的气溶胶本身以及与尼古丁混合雾化后具有复杂的精神神经效应，而对于此类吸入物质脑功能效应的动物模型研究较少，因此雾化物质的神经效应鉴定与筛选等研究任重道远。本研究建立了精准定量的电子烟气溶胶雾化吸入小鼠模型，并为电子雾化产品的成瘾性精神作用评估提供科学依据。