程泽华，王召军，单玉静，刘心瑶，闫筱筱，张洪映，崔红

基因对烟草苗期紫黄质和脱落酸生物合成及烟株耐旱性的影响研究

程泽华，王召军，单玉静，刘心瑶，闫筱筱，张洪映，崔红*

河南农业大学烟草学院，郑州市文化路95号 450002

【】为探究烟草基因在类胡萝卜素和脱落酸合成生物合成中的作用及其对烟株抗旱性的影响。从烤烟品种K326中同源克隆基因，采用生物信息学分析基因序列特征，利用RT-PCR分析其在烟草不同组织的表达模式。利用基因编辑手段创制敲除材料，并分析基因敲除后对烟株类胡萝卜素合成及抗旱性的影响。基因有2个拷贝，和。在烟草根、茎、叶、花中均有表达，的表达水平显著高于。敲除材料与对照相比，紫黄质合成基因显著上调，紫黄质含量显著增加，脱落酸（ABA）合成基因表达量达到对照植株的4倍。干旱胁迫下，敲除材料幼苗与对照相比，叶片萎蔫程度更轻，长势更优，复水处理后生长状态恢复的更好。干旱处理前后，敲除植株中ABA的含量均显著提高。NtMYB68转录因子能抑制和基因表达，敲除该基因可以提高烟叶中紫黄质的积累，促进脱落酸的合成，从而提高烟株抗旱性。

烟草；基因；类胡萝卜素；脱落酸；耐旱性。

类胡萝卜素与烟叶外观质量尤其是颜色密切相关[1-2]，是烟叶内在品质的外在体现。类胡萝卜素是烟叶中性致香物质的重要前体，其降解生成的多种重要致香物质阈值相对较低，刺激性小，香气质较好，对烟叶香气贡献率大，是影响烟叶香气质和香气量的重要组分[3]，邓小华等[4]发现烟叶质量与类胡萝卜素类降解产物的含量关系密切。类胡萝卜素可高效清除体内的自由基，提高植物的抗氧化能力，赵铭钦等[5]认为类胡萝卜素对降低烟气中的自由基损害具有重要意义。此外，类胡萝卜素是合成调控植物耐旱性激素脱落酸（ABA）的前体物质（图1）[6]，可以提高植物的耐旱能力[7]，已有研究表明类胡萝卜素和烟草耐旱性密切关联，王春菲[8]发现番茄红素ε-环化酶可调节烟草抗旱性，王世菊[9]发现在烟草中过表达番茄黄体素合成酶LUT1可提高烟草的抗旱性。因此烟草类胡萝卜素是国内外的研究热点。

MYB转录因子家族是植物中最大的基因家族之一，在植物各种生理活动中，MYB家族成员发挥的功能各不相同。龙葵能够诱导花青素的合成[10]，拟南芥积极响应干旱胁迫[11]。前人研究发现MYB68转录因子参与了柑橘中类胡萝卜素及脱落酸的生物合成[12]，由此推测栽培烟草中的同源基因也可能参与类胡萝卜素及脱落酸的积累。为此本研究从烤烟品种K326中克隆了基因，通过构建基因编辑株系，探究了NtMYB68转录因子在烟草在类胡萝卜素合成途径及逆境胁迫中的作用，为改良烟草品质及抗逆性提供理论基础。

图 1 类胡萝卜素及脱落酸合成途径

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为烟草品种K326。培养于光照培养箱，培养条件为14 h光，（28 ± 1）℃/10 h暗，（24 ± 1）℃，湿度为60% ± 2%。

1.2 基因克隆

1.2.1 烟草叶片 RNA 的提取及 cDNA的合成

依照天根公司RNA提取试剂盒的说明书提取烟草叶、茎、叶、花中的总RNA，并按照Invitrogen公司反转录试剂盒的说明书将所提取的RNA反转录为cDNA。

1.2.2 烟草的基因克隆

以柑橘中基因的编码区序列(GeneBank ID：XM_006475305.3)为问询序列，在茄科基因组网站(https://solgenomics.net/)烟草基因组数据库中进行比对，获得的同源性最高的基因作为候选基因。采用Primer Premier 5.0软件设计两个基因的全长克隆引物（引物序列见表1），以K326叶片cDNA为模板进行扩增。PCR体系为50 μL体系：模板（cDNA）2 μL；正向引物1 μL；反向引物1 μL；Taq酶Mix 25 μL；用水补齐至50 μL。PCR反应程序为：94℃ 5 min；94℃ 15 s，55℃ 5 s，72℃ 60 s，40个循环，72℃ 10 min。PCR扩增产物采用1.5%琼脂糖凝胶电泳检验，产物切胶回收后连接至PMD19-T单克隆载体并转化大肠杆菌，在筛选培养基上培养12 h后挑选阳性菌落提取质粒进行测序。

表1 引物序列

Tab.1 Primer sequences

1.3 生物信息学分析

利用ExPASy ProtParam网站（https://web.expasy. org/compute_pi/）预测蛋白质理化性质，利用NCBI Conserved Domains在线工具（https://www.ncbi.nlm. nih.gov/cdd）分析MYB68蛋白结构域。利用DNAMAN软件进行多序列比对分析。通过MEGA5软件构建系统进化树。

1.4 基因表达模式分析

使用Primer Premier 5.0软件设计荧光定量引物（引物序列见表1），在烟株盛花期时，检测目标基因根、茎、叶和花中的水平。qRT-PCR反应体系为20 μL，包括SYBR Mix 10 μL；正向引物 1 μL；反向引物 1 μL；cDNA模板2 μL；ddH2O添至20 μL。反应程序为95℃，2 min；95℃，15 s，60℃，15 s，72℃，20 s，40个循环；溶解曲线为：95℃，15 s，60℃，15 s，20 min内升至95℃，95℃，15 s。每个反应设置3次技术重复。以烟草核糖体蛋白基因为内参，试验数据采用2－△△CT法计算相对表达量。

1.5 基因敲除载体的构建

采用CRISPR/Cas 9技术对K326中基因进行敲除，利用在线网站（https://zlab.bio/guide- design-resources）在基因第1个外显子上的保守区域设计sgRNA靶点序列（TTAACACTCTATG- GTCAAAT），化学合成靶位点序列及其反向互补序列，退火后形成Oligo二聚体。基因敲除采用孟盈等[13]使用的CRISPR/Cas9载体BGK01，Oligo二聚体与经I酶切后的空载体进行连接，连接产物转化至大肠杆菌DH5α中培养，挑选阳性菌斑，提取质粒进行测序，获得基因敲除载体。

1.6 遗传转化

通过冻融法将敲除载体转入农杆菌EHA105菌株感受态细胞中，通过农杆菌介导的叶盘转化法侵染K326的叶片。在MS培养基上暗培养2 d后转移到含有6.0 mg·L-1潮霉素的筛选分化培养基上（MS培养基+0.15 mg·L-1NAA+1 mg·L-16BA+500 mg·L-1噻孢霉素）。将分化芽移至含6.0 mg·L-1潮霉素的生根瓶中进行培养（MS培养基+0.1 mg·L-1NAA+500 mg·L-1噻孢霉素），等到成苗时将抗性植株移栽至土中并提取DNA，在靶位点上下游设计引物，进行PCR扩增，对PCR产物进行测序筛选靶位点发生碱基突变的株系（引物序列见表1）。

1.7 烟草色素含量的检测

烟苗在漂浮育苗盘上长至七叶一心时，挑选状态一致的烟苗，取大小一致的中部叶片，每10个单株为1组，设置3组作为生物学重复。于液氮速冻后，用冷冻干燥机进行冻干处理，样品质体色素含量测定依照YC/T382—2010[14]。

1.8 类胡萝卜素合成通路基因表达水平的检测

使用Primer Premier 5.0软件设计相关基因的荧光定量引物（引物序列见表1）。其中，八氢番茄红素脱氢酶基因（）、ζ-胡萝卜素异构酶基因（）、ζ-胡萝卜素脱氢酶基因（）、类胡萝卜素异构酶基因（）、番茄红素ε-环化酶基因（）、番茄红素β-环化酶基因（）、ε-环羟化酶基因（）、β-环羟化酶基因（）和玉米黄质环氧化酶基因（）为类胡萝卜素合成通路基因，9-顺式-环氧类胡萝卜素双氧合酶5（）为ABA合成关键基因。以烟苗在七叶一心时中部叶片的cDNA为模板，以烟草核糖体蛋白基因为内参，检测敲除株系类胡萝卜素合成通路基因表达量变化。总RNA的提取和cDNA的合成与1.2.1相同，qRT-PCR反应体系和程序与1.4相同。

1.9 烟草干旱处理

烟苗在漂浮育苗盘上长至七叶一心时，将漂浮育苗盘控水后悬空置于高架上，在自然条件下干旱7 d，观察其表型变化，并取干旱第0 d和第7 d时大小一致的中部叶片作为脱落酸检测用，每3个单株为1组，设置3组作为生物学重复。样品去掉主脉后于液氮中速冻，保存于-80℃备用。

1.10 烟草脱落酸的检测

依照刘中明等的方法[15]测定超低温保存样本的脱落酸含量。

1.11 数据分析

使用Excel软件对试验数据进行统计处理和绘制图表，使用SPSS17.0软件进行方差分析（单因素ANOVA），利用最小显著差数法（LSD 检验，<0.05）进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 NtMYB68基因克隆及生物信息学分析

在烟草数据库中获得2个与柑橘基因同源性最高的基因（Nitab4.5_0000540g0020.1和Nitab4.5_0003781g0060.1），分别命名为和。经克隆、测序发现，和编码区全长分别为816 bp和813 bp。NtMYB68-1编码271个氨基酸，NtMYB68-2编码270个氨基酸，NtMYB68-2与NtMYB68-1相比在第123位缺失了1个天冬酰胺残基，二者核苷酸相似性为92.77%（图2）。

利用NCBI Conserved Domains在线工具（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）分析NtMYB68蛋白结构域，发现MYB68具有2个典型的MYB结构域，是一个R2R3-MYB蛋白。蛋白系统进化树分析结果表明，NtMYB68-1和绒毛状烟草NtomMYB68的相似性为99.26%，NtMYB68-2和林烟草NsylMYB68的相似性达100%（图3）。在白肋烟TN90、香料烟巴斯玛基因组中均发现了与-1和-2序列分别相同的2个拷贝。本氏烟中也存在2个拷贝，NtMYB68-1与本氏烟NbMYB68-1、NbMYB68-2的相似性分别为86.81%、87.50%；NtMYB68-2和本氏烟NbMYB68-1、NbMYB68-2的相似性分别为86.81%、87.13%。与其它物种比对发现，NtMYB68-1、NtMYB68-2和番茄SlMYB68的相似性分别为60.74%、53.55%，与拟南芥AtMYB68的相似性分别为38.39%、34.52%，同柑橘CrMYB68的相似性则分别为43.96%、42.65%。以上结果表明NtMYB68在不同类型、不同品种的栽培烟草中高度保守，且与本氏烟中NbMYB68亲缘关系较近，但与番茄SlMYB68、拟南芥AtMYB68和柑橘CrMYB68之间差异较大，亲缘关系较远。

注：NtMYB68：普通烟草；NsylMYB68：林烟草；NtomMYB68：绒毛状烟草；NbMYB68：本氏烟。

图3 不同物种MYB68的系统进化树分析

2.2 NtMYB68基因表达模式分析

为研究的组织表达特性，采用qRT-PCR分别对K326的根、茎、叶、花中表达水平进行检测分析，结果显示，和在根、茎、叶、花中均有表达，但基因在各个组织的表达量远高于基因表达量（图4），由此推测发挥着更主要的功能。

图4 NtMYB68基因组织表达特异性分析

2.3 NtMYB68基因编辑材料的创制

利用农杆菌介导法将敲除载体转化K326，获得了10株潮霉素抗性苗，经PCR扩增和测序后有4株在gRNA区域发生突变，基因编辑率为40%，测序发现M106号单株（图5B、C）为纯合突变，其基因缺失了2个A碱基，基因插入了1个A碱基，导致的开放阅读框发生移码突变并造成翻译提前终止。

注：A. 野生型NtMYB68 sgRNA序列B. M106单株NtMYB68-1 sgRNA序列C. M106单株NtMYB68-2 sgRNA序列。

2.4 NtMYB68基因敲除对类胡萝卜素含量的影响

对M106株系及对照K326幼苗的类胡萝卜素含量进行检测，结果如图6所示，敲除株系中叶黄素、β-胡萝卜素、新黄质和紫黄质含量分别为1921.7 μg/g、1484.87 μg/g、556.34 μg/g、208.65 μg/g，对照株系叶黄素、β-胡萝卜素、新黄质和紫黄质含量分别为1908.68 μg/g、1468.60 μg/g、518.16 μg/g、68.51 μg/g。与对照相比，敲除株系的叶黄素、β-胡萝卜素、新黄质含量无显著差异，而紫黄质含量极显著高于对照株系，是对照株系的3倍。该结果表明基因敲除可以提高烟叶中紫黄质的积累。

注: 图中*表示不同材料间差异在P < 0.05具有显著性; **表示不同材料间差异在P < 0.01水平具有显著性。

2.5 NtMYB68基因敲除对类胡萝卜素合成通路基因表达水平的影响

对M106株系及对照K326幼苗的类胡萝卜素合成通路基因表达水平进行检测，结果如图7所示，与对照株系相比，敲除株系中类胡萝卜素合成通路上游的、、、、、和基因表达量不存在显著差异，而基因表达量显著上调，表达量接近对照的2倍，表达量接近对照株系的4倍。是植物调控紫黄质积累的关键基因，敲除基因后，的表达量极显著上升，意味着紫黄质积累速度加快，这与敲除株系中色素含量的积累规律基本一致，证明基因敲除提高了烟叶紫黄质合成的能力，促进了紫黄质的积累。而基因是ABA合成的关键基因，该基因表达量极显著提高。

注: 图中*表示不同材料间差异在P < 0.05具有显著性; **表示不同材料间差异在P < 0.01水平具有显著性。

2.6 NtMYB68基因敲除对ABA合成通路相关基因及抗旱性的影响

对M106株系及对照K326幼苗进行干旱处理，结果如图8所示，干旱处理4 d后，敲除株系与K326烟苗表现出明显差异，K326烟苗叶片变黄，萎蔫严重，表现严重的缺水症状，而敲除株系只有下部叶片出现萎蔫，上部幼嫩叶片仍然保持挺立状态（图8B），而复水处理12 h后敲除株系已经恢复到较好状态，但对照烟苗仍然处于萎蔫状态（图8C），表明基因敲除提高了烟株抗旱性。

对干旱处理前后的M106和K326的脱落酸含量分别进行检测，结果显示（图8D），未进行干旱处理的烟苗中，M106的脱落酸明显提高，为K326的1.5倍，干旱处理后M106和K326的脱落酸含量均提高，但M106中脱落酸的含量仍然极显著高于K326。对干旱胁迫下M106和K326的脱落酸合成通路基因、和表达量变化的检测结果显示（图8E），经干旱处理，M106和K326的所有基因表达量均有不同程度的上调。与K326相比，M106的基因表达量无显著差异，而和基因表达量在干旱处理前后均显著高于K326，特别是，其基因表达量在干旱处理前后分别为K326的2.10、1.75倍。该结果表明，基因敲除提高了烟苗中脱落酸的含量，这与ABA合成关键基因的表达量变化趋势一致，而脱落酸含量的增加提高了烟株的耐旱性。

注：A，干旱第0 d；B，干旱第4 d；C，复水后12 h；D，干旱胁迫下ABA含量变化；E，干旱胁迫下ABA合成通路NtBCH基因表达量变化；F，干旱胁迫下ABA合成通路NtZEP基因表达量变化；G，干旱胁迫下ABA合成通路NtNCED5基因表达量变化。

3 讨论与结论

本研究中从烟草中克隆了基因，并进行了功能研究。烟草中基因有2个拷贝，根据序列比对推测可能来源于绒毛烟草，可能来源于林烟草。组织表达模式分析显示基因在烟草各个组织中都有表达，其中在叶中高表达而在根中高表达、茎中次之，且的表达水平远大于，据此推测二者可能出现了功能分化，还需要对和分别进行功能研究来验证。

类胡萝卜素的合成除了受结构基因控制外，还受到转录因子调控，特别是MYB转录因子家族[16-17]。前人在柑橘中研究发现是类胡萝卜素合成的重要调控基因[12]，与之相似，本研究发现敲除株系紫黄质含量达到对照3倍，说明也参与调控烟草类胡萝卜素合成。但柑橘基因突变后，α-和β-胡萝卜素及玉米黄质的含量发生明显变化，而本研究发现烟草中只有紫黄质响应基因的敲除。柑橘基因能够调控基因表达，而在烟草中基因则调控紫黄质合成基因表达。这可能是因为部分同源基因在不同物种间存在功能差异，如柑橘和拟南芥基因在进化分支上虽较为接近，但功能仍存在差异[18]。

紫黄质可以消耗过剩光能，保护叶绿素及光反应复合体，同时减轻活性氧的危害，保护细胞膜免受破坏[19]。本研究创制的敲除株系的紫黄质含量达到对照3倍，由此推测敲除株系烟叶发育及物质积累更加完善，从而有利于烤后烟叶的外观质量及内在品质。此外，包括紫黄质在内的叶黄素类物质可以裂解生成多种香气成分[9]，改善烟叶香吃味，增加烟气舒适感，提高烤后烟叶品质，预示着敲除可以提高烟叶香气品质，因此对敲除株系生长发育全过程的研究以及烟叶品质的分析将是下一步研究重点。

MYB基因家族功能多样与植物生长发育和逆境胁迫密切相关[20-21]。本研究发现敲除后，和基因表达量显著上调，其中玉米黄质环氧化是ABA的第一个关键步骤，则是ABA合成的关键基因[22]。研究发现基因在茎和叶中高表达[23]，基因则在根中表达量较高[24]，这与在根、茎中的表达丰度高度吻合，预示着比在类胡萝卜素合成及烟株耐旱响应中发挥更重要的作用。干旱胁迫下，敲除株系ABA合成通路基因和表达水平极显著高于对照，敲除株系的脱落酸含量也极显著增加，与之相应的，干旱胁迫下敲除株系的耐受能力显著高于对照株系。以上结果预示可以直接参与调控ABA的合成，进而影响烟草耐旱性。因此该基因在培育烟草耐旱新品种上具有重要价值。

本研究中只在苗期对敲除株系的类胡萝卜素含量及烟苗抗旱能力进行了分析，下一步还需要对敲除株系的生长发育全过程进行研究，以阐明敲除对烟株农艺性状、烟叶质量及抗逆性的影响，从而更好评估该基因在烟草品质及抗性育种中的应用潜力，为烟草优质高抗的定向分子改良奠定基础。

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Effect ofGene on Tobacco Seedlings Violaxanthin and Abscisic Acid Biosynthesis, and Drought Tolerance Effects ofgene on biosynthesis of flaxanthin and abscisic acid and drought tolerance of tobacco plants at seedling stage

CHENG Zehua, WANG Zhaojun, SHAN Yujing, LIU Xinyao, YAN Xiaoxiao, ZHANG Hongying, CUI Hong*

Henan Agricultural University, College of Tobacco Science, No. 95 Wenhua Road, Zhengzhou 450002

This study aims to explore the effect ofgene on the biosynthesis of carotenoids and abscisic acid and the drought resistance of tobacco plants at seedling stage.Thegene was cloned from flue-cured tobacco variety K326. Thegene sequence characteristics were analyzed by bioinformatics, and its expression pattern in different tobacco tissues was analyzed by RT-PCR. Gene editing technology was used to create a homozygous mutant line of thegene, and the effects ofgene knock-out on tobacco carotenoid synthesis and drought resistance were analyzed.There are 2 copies ofgene, including-1 and-2.is expressed in tobacco roots, stems, leaves and flowers, and the expression level of-2 is significantly higher than that of-1. Compared with the control, the violaxanthin synthesis genewas significantly up-regulated in theknock-out material, and the violaxanthin content was significantly increased. The expression level of the abscisic acid (ABA) synthesis genewas 4 times that of the control material. Under drought stress, compared with the control, the knock-out material seedlings showed lower degree of leaf wilting, better growth, and better growth recovery after rewatering. Before and after drought treatment, the content of ABA in the knock-out material was significantly increased.NtMYB68 transcription factor can inhibit the expression ofandgenes, knocking out this gene can increase the accumulation of violaxanthin in tobacco leaves and promote the synthesis of abscisic acid, thereby improving the drought resistance of tobacco.

tobacco;gene; Carotenoid; abscisic acid; drought tolerance

. Email：cuihonger_13@163.com

程泽华，王召军，单玉静，等. NtMYB68基因对烟草苗期紫黄质和脱落酸生物合成及烟株耐旱性的影响研究[J]. 中国烟草学报，2022，28（2）.CHENG Zehua, WANG Zhaojun, SHAN Yujing, et al. Effect of NtMYB68 Gene on Tobacco Seedlings Violaxanthin and Abscisic Acid Biosynthesis, and Drought Tolerance Effects of NtMYB68 gene on biosynthesis of flaxanthin and abscisic acid and drought tolerance of tobacco plants at seedling stage[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2022, 28(2).doi:10.16472/j.chinatobacco. 2021.T0186

中国烟草总公司烤烟基因组计划和生物育种重大专项项目“烤烟叶面化学成分的分子调控和定向改良”（110202101005（JY-05）

程泽华（1997—），硕士研究生，烟草生物技术，Tel：13598538622，Email：879447518@qq.com

崔红（1966—），Tel：13526826768，Email：cuihonger_13@163.com

2021-10-15；

2022-03-07