徐海刚，刘佳慧，熊 智

（1.贵州轻工职业技术学院，贵州 贵阳 550000；2.西南林业大学 生命科学学院，云南 昆明 650000；3.贵州省农作物技术推广总站，贵州 贵阳 550000）

解淀粉芽孢杆菌属于一种对人畜无毒害的G+细菌[1]，产芽孢，具有防治植物病害、促进植物生长、改善根际土壤微生物种群结构等作用，对于病害防治、植物促生和果蔬采后保鲜等具有重要意义[2]。

解淀粉芽孢杆菌是一类高效、安全、多功能并且具有极大的开发潜力的微生物菌种，应用广泛[3-6]。例如，解淀粉芽孢杆菌可以通过产生3-吲哚乙酸以及其他代谢产物促进农作物生长，其合成的脂肽类化合物、聚酮类化合物、细菌素能够对土壤中的致病菌产生拮抗作用[7]，抑制病原菌的生长或繁殖，从而达到防治病害的作用[8]；脂肽是芽孢杆菌非核糖体多肽合成酶系产生的次级代谢产物，因广谱抑菌、低耐药性、可生物降解、安全低毒，被视为安全健康的抗菌分子[9]；板蓝根经解淀粉芽孢杆菌固态发酵后可显著提高(R,S)-告依春含量[10]。

淀粉酶是近年来引起工业界广泛关注的一类酶，约占世界酶市场份额的25%[11]。α-淀粉酶是一类作用于淀粉内部通过水解α-1,4 糖苷键从而将淀粉水解为糊精、低聚糖和单糖的酶，该类酶已被广泛应用于面包生产及洗涤等工艺中[12]。其中酸性α-淀粉酶可以广泛应用于发酵、饲料、食品和生物制药等多个领域[13]。另外高产淀粉酶菌株往往具有高糖化作用，对于提高白酒出酒率和缩短白酒酿造周期具有重要的作用[12,14]。

解淀粉酶芽孢杆菌作为重要的生防芽孢杆菌，其代谢产物有脂肽、抗菌蛋白、大环内酯类等，可以有效抑制病原真菌，被广泛应用于生物防治、食品保鲜加工等领域[15-16]。本文以实验室筛选出的解淀粉芽孢杆菌为实验菌株，通过液态培养基发酵，对淀粉浓度、接种量、发酵时间、培养基pH 4 个因素进行了单因素和正交试验，确定了解淀粉芽孢杆菌产α-淀粉酶的最佳发酵条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验菌株

解淀粉芽孢杆菌菌株，由贵州轻工职业技术学院实验室筛选分离。

1.1.2 培养基

（1）富集培养基。蛋白胨5 g，硫酸铵2 g，牛肉膏5 g，磷酸氢二钾5 g，氯化钙0.1 g，氯化钠5 g，七水硫酸镁0.2 g，水1 000 mL。

（2）种子培养基。蛋白胨5 g，硫酸铵2 g，磷酸氢二钾5 g，牛肉膏5 g，七水硫酸镁0.2 g，氯化钙 0.1 g，氯化钠5 g，水1 000 mL。

1.1.3 试剂

主要试剂见表1。

表1 实验试剂

1.1.4 主要仪器

主要实验仪器见表2。

表2 实验仪器表

1.2 实验方法

1.2.1 试剂的制备

（1）原碘液的配制。用天平分别称量碘11 g、碘化钾22 g，用去离子水溶解并用500 mL 容量瓶定容。

（2）稀碘液。用移液管移取（1）中溶液2 mL 于去离子水中，并用500 mL 容量瓶定容。

（3）20 g·L-1可溶性淀粉溶液。称量2 g 可溶性淀粉，并用100 mL 容量瓶定容。

（4）磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液（pH 值6.5）。分别配制0.2 mol·L-1的磷酸氢二钠溶液和0.1 mol·L-1的柠檬酸溶液，借助pH 计配制不同pH 值的缓冲溶液，备用[17]。

（5）酶解反应终止液。称取氯化铜1.003 2 g，用蒸馏水定容至10 mL；取37%的盐酸9 mL，稀释至90 mL，将二者混合即为终止液，备用[18]。

1.2.2 酶活力测定

样品管：取一组比色管，分别加入1.00 mL 不同浓度的α-淀粉酶溶液；标准试管：用1.00 mL 的缓冲溶液代替酶液。在37 ℃的水浴中恒温2 min后，依次加入同温度预热的0.008 g·mL-1淀粉溶液 5 mL，然后立刻搅拌均匀。在37 ℃下反应10 min，加入1 mL 的停止溶液。摇匀之后，将其冷却至室温，分别取0.2 mL 于试管中，加入7 mL 碘液，摇匀，在580 nm 处测定吸光度，以相同浓度的淀粉在加入不同量α-淀粉酶前后吸光度的变化为依据，测量α-淀粉酶活性，酶活力按式（1）计算[17]。

式中：4 表示样品管和标准管中淀粉量均为 5 mL 0.8%的淀粉；AX为样品管中吸光度；AS为标准管中吸光度。

1.3 单因素试验设计

1.3.1 pH 值对解淀粉芽孢杆菌产淀粉酶酶活力的影响

选择发酵时间48 h，淀粉浓度2%，接种量6%，研究酵培养基初始pH 值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）对解淀粉芽孢杆菌产淀粉酶酶活力的影响。

1.3.2 发酵时间对解淀粉芽孢杆菌产淀粉酶酶活力的影响

选择pH=7.0，接种量为6%，淀粉浓度2%，研究发酵培养时间（24 h、36 h、48 h、60 h、72 h）对解淀粉芽孢杆菌产淀粉酶酶活力的影响。

1.3.3 接种量对解淀粉芽孢杆菌产淀粉酶酶活力的影响

选择pH=7.0，淀粉浓度2%，培养48 h，研究接种量（2%、4%、6%、8%、10%）对解淀粉芽孢杆菌产淀粉酶酶活力的影响。

1.3.4 淀粉浓度对解淀粉芽孢杆菌产淀粉酶酶活力的影响

选择pH=7.0，接种量6%，发酵48 h，研究培养基淀粉浓度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）对解淀粉芽孢杆菌产淀粉酶酶活力的影响。

1.4 正交试验设计

以单因素试验为基础，通过正交试验进一步优化解淀粉芽孢杆菌产α-淀粉发酵条件。设计4 因素3 水平，按L9(34)进行实验[19]，以酶活力为指标，选择最佳发酵条件，正交试验因素水平表见表3。

表3 正交试验因素水平表

2 结果与分析

2.1 pH 值对解淀粉芽孢杆菌产淀粉酶酶活力的影响

如图1 所示，随着解淀粉芽孢杆菌发酵液初始pH 值的增大，酶活力呈先升高后降低的趋势，当pH值为7.0 时酶活力最高，pH 值为5.0 ～6.0 对产淀粉酶活力影响不大。出现上述结果可能是由于微生物具有自身保护细胞的正常新陈代谢和产酶机制的调节能力，外界酸碱度对其代谢和产酶具有重要的影响作用，这种情况导致了细胞内酸碱度受到了一定程度影响，进而对菌株的新陈代谢及产酶反应造成一定的影响。

图1 pH 值对产酶的影响

2.2 发酵时间对解淀粉芽孢杆菌产淀粉酶酶活力的影响

如图2 所示，随着发酵时间的增加，酶活力呈先升高后降低的趋势，当发酵时间为48 h 时，酶活力最高，因此48 h 是最适发酵时间。

图2 发酵时间对产酶的影响

2.3 接种量对解淀粉芽孢杆菌产淀粉酶酶活力的影响

接种量的不同会影响发酵时间和酶生产。当接种量太小时，会延长延滞期，引起菌体浓度降低，最后导致α-淀粉酶产量减小；当接种量太大时，菌体的数量过多会导致空间内的氧气和养料不够，从而影响菌种的生长，最终导致α-淀粉酶降低。如图3 所示，淀粉酶活力随着接种量的增加先升高后降低，特别是接种量在2%～4%时酶活力上升的速率最快；在接种量大于4%时酶活力的上升幅度减缓，当接种量达到6%时淀粉的酶活力最高，超过6%后酶活力又迅速降低。低密度菌株相对底物的生物值比较丰富，由于菌株的大量繁殖，其代谢更加旺盛。密度高的菌株新陈代谢及产酶所需消化生物质的量很大，会使其产生出小于菌株生长所需时酶活力下降的情况。通过研究表明微生物的接种量对发酵过程具有重要作用[19-20]。

图3 接种量对产酶的影响

2.4 淀粉浓度对解淀粉芽孢杆菌产淀粉酶酶活力的影响

淀粉不仅是氮源，还能提供多种微量元素与生长因子。从图4 可以看出，当淀粉浓度在0.5%～1.5%时，酶活力呈现缓慢上升趋势，当淀粉浓度达到1.5%时酶活力最高；淀粉浓度为1.5%～2.0%时酶活力呈下降趋势，继续增大淀粉浓度，酶活力不再下降。

图4 淀粉浓度对产酶的影响

2.5 正交实验分析

正交试验结果见表4，方差分析结果见表5。比较4 个因素的极差可知，影响解淀粉芽孢杆菌产淀粉酶因素的大小顺序为淀粉浓度＞菌种接种量＞培养基pH 值＞发酵时间，即淀粉浓度对解淀粉芽孢杆菌产淀粉酶的影响最大，其次是菌种接种量、培养基pH 值，最后是发酵时间；同时由方差分析结果可以看出，培养基pH 值、发酵时间、接种量及淀粉浓度对菌株水解淀粉试验过程中的影响都极显著。K值分析可知，A3B3C1D2为最佳组合，即培养基pH=8.0、发酵时间60 h、菌种接种量4%、淀粉浓度1.5%。将以上优化的最佳发酵条件A3B3C1D2产出的酶活力与正交试验表中直接得出的最佳发酵条件A2B3C1D2产出的酶活力进行对照，得出A3B3C1D2为最佳 （399.3 U·mL-1）。

表4 正交试验方案和试验结果

表5 正交实验方差分析表

3 结论

解淀粉芽孢杆菌是一类高效、安全、多功能并且具有极大的开发潜力的微生物菌种，应用广泛[21-22]。 本文通过单因素试验和正交试验得出解淀粉芽孢杆菌产α-淀粉酶的最佳发酵条件为培养基pH=8.0、发酵时间60 h、菌种接种量4%、淀粉浓度1.5%，在此条件下生产淀粉芽孢杆菌产α-淀粉酶酶活力相对最高（399.3 U·mL-1），为α-淀粉酶的工业生产提供了理论数据。