孙国强，董金颖，曹发昊

（1.山西瑞芝生物科技有限公司，山西 运城 044000；2.运城学院，山西 运城 044000）

灵芝（Ganoderma lucidum）也叫瑞草、仙草等，为名贵的药用真菌[1]。现代医学表明，灵芝具有调节免疫力、抗肿瘤、抗衰老、保肝和提高机体缺氧耐受力等活性[2-7]。目前，灵芝子实体和孢子主要作为保健食品应用，但不管是野生采摘还是人工栽培的灵芝都极易受自然条件限制，生产效率低，产品质量波动大，生产规模远不能满足市场需求[8]。近年来，采用液态发酵技术生产灵芝菌丝，实现了规模化量产，成为解决上述问题的重要途径[9]。研究表明，灵芝菌丝与子实体的营养成分十分相似，对人体同样有功效作用[10]。

目前，国内外针对灵芝子实体和灵芝孢子及其产品的毒理学安全性评价研究已经开展了很多[11-17]，但针对菌丝的相关报道很少[18-19]，其作为食品应用的毒理学研究不够深入，尚缺安全性评价数据支持。将灵芝菌丝作为原料加工成食品，可有效增加灵芝的附加值，产生较大的经济和社会价值，因此开展其毒理学安全性评价试验尤为重要。本研究较系统地对灵芝菌丝的急性毒性、遗传毒性等进行了研究，以期为灵芝菌丝的安全食用提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试品

灵芝菌丝粉，由山西瑞芝生物科技有限公司培养灵芝菌丝，经干燥、粉碎制得，该供试样品为棕色粉末，置密闭、阴凉干燥处储存。推荐成人服用量为3.0 g/（60 kg·d）。

1.2 动物

SD 大鼠和ICR 小鼠由上海斯莱克试验动物有限责任公司提供，试验动物生产许可证号为SCXK(沪)2012-0002。试验动物饲料由浙江省试验动物中心提供，执行标准为GB 14924.1—2001。试验动物使用许可证号为SYXK(浙)2013-0190，试验动物室温度为20 ～24 ℃，相对湿度为40%～70%。

1.3 仪器与试剂

超净工作台（上海博迅实业有限公司）；生物显微镜（深圳盛天仪器有限公司）；7180 型全自动生化分析仪[日立（中国）有限公司]；XT-1800i 型全自动血细胞分析仪（日本SYSMEX 株式会社）。

环磷酰胺CTX（上海华联制药公司）；丝裂霉素C（江苏恒瑞医药股份有限公司）；叠氮钠（NaN3）、1,8二羟基蒽醌、2-AF、柔毛霉素、ICR-191（Sigma公司）。多氯联苯诱导制备大鼠肝S9，经2-AF 和1,8-二羟基蒽醌测试具有生物活性，冷冻保存。TA97、TA98、TA100、TA1024 种鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型菌株由上海疾病预防控制中心毒理科提供，经生物学鉴定合格后用于试验。

1.4 急性经口毒性试验方法

1.4.1 大鼠急性经口毒性试验

选择最大耐受剂量法进行大鼠急性经口毒性试验。选20 只体重180 ～220 g 的SD 大鼠，雌雄各10 只。染毒前，禁食过夜但不限制饮水。设20 g·kg-1体重一个剂量组（相当于推荐人服用量的400 倍），采用经口灌胃方式，将灵芝菌丝粉碎后称取100 g 加去离子水至200 mL 配成0.50 g·mL-1（最大可灌胃浓度），按20 mL·kg-1体重，灌胃2 次，每次间隔4 h。染毒后观察小鼠的一般情况、中毒症状和死亡情况，观察期限2 周。

1.4.2 小鼠急性经口毒性试验

选择最大耐受剂量法进行小鼠急性经口毒性试验。选20 只18 ～22 g 体重的ICR 小鼠，雌雄各10 只。染毒前，禁食过夜但不限制饮水。设20 g·kg-1体重一个剂量组（相当于推荐人服用量的400 倍）。用经口灌胃方式，将灵芝菌丝粉碎后称取100 g 加去离子水至200 mL 配成0.50 g·mL-1（最大可灌胃浓度），按20 mL·kg-1体重，灌胃2 次，每次间隔4 h。染毒后观察小鼠的一般情况、中毒症状和死亡情况，观察期限2 周。

1.5 遗传毒性试验方法

1.5.1 Ames 试验

试验选用经生物学鉴定为合格的TA97、TA98、TA100、TA1024 种鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型菌株。采用平板掺入法，选择5 000 μg/皿为最高剂量。称取灵芝菌丝1.0 g 加去离子水至20 mL，充分混匀，配成50 000 μg·mL-1，用去离子水依次5 倍稀 释 成80 μg·mL-1、400 μg·mL-1、2 000 μg·mL-1、 10 000 μg·mL-1，各浓度均经121 ℃、20 min 湿热灭菌后用于试验。每个培养皿加0.1 mL，即剂量分别为8 μg/ 皿、40 μg/ 皿、200 μg/ 皿、1 000 μg/ 皿、5 000 μg/皿。同时设有空白对照组、溶剂（H2O）对照组及阳性对照组（ICR-191、2-AF、丝裂霉素C、NaN3、柔毛霉素、1,8-二羟基蒽醌），各种菌株每个测试浓度设3 个平行皿，在加、不加S9两种条件下试验，重复测试一次。直接计数各培养基上菌株的回变菌落数。

1.5.2 小鼠骨髓细胞微核试验

采用间隔24 h 二次给予样品进行小鼠骨髓细胞微核试验。25 ～30 g 体重的50 只ICR 小鼠，随机分为5 组，每组雌、雄各5 只。设3 个剂量组 2.5 g·kg-1、5.0 g·kg-1、10.0 g·kg-1体重（分别相当于推荐人服用量的50、100 和200 倍），用去离子水配制。并设阴性对照、阳性对照组（CTX 0.06 g·kg-1）， 3 个剂量组分别称取灵芝菌丝25 g、50 g、100 g，然后分别加去离子水至200 mL 配成0.125 g·mL-1、 0.250 g·mL-1、0.500 g·mL-1的试样，再按20 mL·kg-1灌胃；对照组也作相同处理。以最后一次给灵芝菌丝后计时6 h，处死小鼠后再取其股骨骨髓制片，用甲醇固定Giemsa 染色后再进行镜检，每只小鼠计数PCE（嗜多染红细胞）1 000 个来计算微核率。

1.5.3 小鼠精子畸形试验

选50 只25 ～35 g 体重的ICR 小鼠，每组雌、雄各5 只，随机分成5 组。设3 个剂量组2.5 g·kg-1、 5.0 g·kg-1、10.0 g·kg-1体重（分别相当于推荐人服用量的50、100 和200 倍），用去离子水配制。另设阴性对照、阳性对照组（丝裂霉素C 0.002 g·kg-1）。 3 个剂量组分别称取灵芝菌丝25 g、50 g 和100 g， 然后加去离子水至200 mL 配成0.125 g·mL-1、 0.250 g·mL-1、0.500 g·mL-1的试样，再按20 mL·kg-1连续灌胃5 d；对照组也作相同处理。在首次给试样的第35 天以颈椎脱臼法处死小鼠，将每组的各只小鼠两侧附睾取下，放入已加入适量生理盐水的平皿，附睾用剪刀剪碎后用4 层擦镜纸吸滤，涂片后自然干燥，再用甲醇固定后以1%伊红进行染色。高倍镜下检查精子形态，每只小鼠查看1 000 个完整精子，记录畸变精子类型和数目，计算畸形率。

1.6 大鼠30 d 喂养试验

选80 只50 ～70 g 体重的SD 大鼠，每组雌雄各10 只，随机分为4 组。大鼠自由进食和饮水采用单笼饲养。设3 个剂量组和1 个阴性对照组，高、中、低3个剂量分别为5.00 g·kg-1、2.50 g·kg-1、 1.25 g·kg-1，相当于推荐人服用量的100、50 和25 倍。试验以给予饲料喂养的方式，按体重的10%折算灵芝菌丝用量，采用逐级放大方式充分均匀拌入各个剂量组的基础饲料中，各剂量均制作20 kg 加药饲料。高、中、低3 个剂量组灵芝菌丝加入量为1 000 g、500 g、250 g：干酪素加入量为200 g、100 g、50 g。高、中、低3 个剂量组灵芝菌丝分别占饲料的5.0%、2.5%、1.25%。连续观察30 d，每周记体重1 次、进食量2 次，核算食物利用率。试验末期即第4 周，称体重后禁食过夜，次日在空腹称体重后从颈静脉取血进行血液学和血生化指标检测。大体解剖所有大鼠，将肝、肾、脾、睾丸（卵巢）称重，计算其脏体比。同时，对脏器进行病理组织学检查。

1.7 统计学方法

试验数据采用SPSS 11.5 进行统计分析，数据采用“X—±S”样式。先对数据进行方差齐性检验，方差齐时选用单因素方差分析法进行总体比较，若存在差异，再与对照组的试验数据进行均数间的两两相比；原始数据不满足方差齐性时，可选用秩和检验。

2 结果与分析

2.1 急性经口毒性试验结果

2.1.1 大鼠急性经口毒性试验结果

从表1 可以看出，染毒后观察期内大鼠未出现中毒症状和死亡。该灵芝菌丝的雌、雄两性别急性经口最大耐受剂量均＞20 g·kg-1体重，属无毒级。

表1 大鼠急性经口毒性试验结果

2.1.2 小鼠急性经口毒性试验结果

从表2 可以看出，染毒后观察期间试验小鼠未出现中毒症状，也无死亡。该灵芝菌丝的雌、雄两性别的急性经口最大耐受剂量均＞20 g·kg-1体重，属无毒级。

表2 小鼠急性经口毒性试验结果

2.2 遗传毒性试验结果

2.2.1 Ames 试验结果

从表3、表4 可见，在加不加S9两种条件下，灵芝菌丝各个剂量的回变菌落数都未超过空白对照组和溶剂对照组的2 倍，再者各剂量组别之间无明显的剂量反应关系，该灵芝菌丝细菌回复突变试验的结果为阴性。

表3 第一次Ames 试验结果

表4 第二次Ames 试验结果

2.2.2 小鼠骨髓细胞微核试验结果

从表5 可以看出，各个剂量组的嗜多染红细胞（Polychromatic Erythrocyte，PCE）与红细胞（Red Blood Cell，RBC）总数的比值（PCE/RBC）均不少于对照组的20%，因而不具有骨髓抑制作用。再用泊松检验法统计，比较各剂量组与阴性对照组的微核率，差异无显著性（P＞0.05），表明灵芝菌丝哺乳动物红细胞微核试验的结果是阴性的。

表5 小鼠骨髓细胞微核试验结果

2.2.3 小鼠精子畸形试验结果

从表6 可以看出，采用秩和检验统计分析，比较各剂量组和阴性对照组的精子畸形率，均无显著性差异（P＞0.05），说明灵芝菌丝小鼠精子畸形试验的结果为阴性。

表6 小鼠精子畸形试验结果

2.3 大鼠30 d 喂养试验结果

以1.25 g·kg-1、2.50 g·kg-1和5.00 g·kg-1剂量（相当于推荐人服用量的25、50 和100 倍）的样品连续喂养大鼠30 d，试验期间各组大鼠均没有出现异常症状和体征，也无死亡。

2.3.1 对大鼠体重、周进食量、食物利用率的影响从表7、表8、表9 可以看出，比较高、中、低三剂量组与阴性对照组的大鼠体重、周进食量、总进食量、食物利用率以及体重增重量，经方差分析或秩和检验均无显著性差异（P＞0.05）。

表7 灵芝菌丝对大鼠体重的影响

表8 灵芝菌丝对大鼠周进食量的影响

表9 灵芝菌丝对大鼠食物利用率的影响

2.3.2 对大鼠血液学指标的影响

从表10、表11 可以看出，比较各剂量组与阴性对照组大鼠的白细胞数、红细胞数、血红蛋白、淋巴细胞、单核细胞和粒细胞，经方差分析或秩和检验均无显著性差异（P＞0.05）。

表10 灵芝菌丝对大鼠白细胞数、红细胞数、血红蛋白的影响

2.3.3 对大鼠血生化指标的影响

从表12、表13 可以看出，比较各剂量组与阴性对照组大鼠的血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮、肌酐、甘油三酯、总胆固醇、总蛋白、白蛋白、球蛋白、白蛋白/球蛋白和血糖，经方差分析或秩和检验均无显著性差异（P＞0.05）。

表12 灵芝菌丝对大鼠丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮、肌酐、甘油三酯和总胆固醇的影响

表13 灵芝菌丝对大鼠总蛋白、白蛋白、球蛋白、白/球比和血糖的影响

2.3.4 对大鼠脏器重和脏体比的影响

从表14、表15 可以看出，比较各个剂量组与阴性对照组大鼠的肝、肾、脾、睾丸（卵巢）重、各脏体比[肝/体、肾/体、脾/体、睾丸（卵巢）/体]，经方差分析或秩和检验均无显著性差异（P＞0.05）。

表14 灵芝菌丝对大鼠肝、肾、脾、睾丸（卵巢）重的影响

表15 灵芝菌丝对大鼠周脏体比的影响

2.3.5 大鼠病理组织学检查结果

从表16 可以看出，大体解剖未见明显异常，各脏器的组织学改变多为散发，阴性对照组和高剂量组中差别不明显，所以可判断各脏器的改变与灵芝菌丝的作用无直接因果关系。

表16 灵芝菌丝病理学组织观察结果 （单位：只）

（续表16）

3 结论

参照国家相关法规[20-21]和相关文献[22-24]，对灵芝菌丝进行了毒理学安全性评价研究。试验结果表明，当灵芝菌丝以最大给药量20 g·kg-1（相当于人推荐服用剂量的400 倍）经口方式给小鼠灌胃后，小鼠没有出现中毒症状及死亡，急性经口毒性为无毒。3项遗传毒性试验的结果也都是阴性。大鼠30 d 喂养试验，以5.00 g·kg-1、2.50 g·kg-1、1.25 g·kg-1剂量（分别相当于推荐人体用量的100、50、25 倍）的样品 30 d 连续喂养大鼠，所有大鼠试验期内均未见异常症状和体征，也无死亡。所有大鼠的体重、体重增重、周进食量、总进食量、食物利用率、血常规和血液生化指标、脏器重及脏体比等都未发生明显变化；经大体解剖和组织病理学检查，所有大鼠均未出现与灵芝菌丝有关的异常变化，表明灵芝菌丝30 d 喂养对大鼠未产生毒副作用。上述结论表明，灵芝菌丝具备无遗传毒性、无致突变性的特点，本研究为灵芝菌丝产品的开发提供了科学依据，对推动灵芝产业的发展有积极意义。