王乾丽，简银池，黄永桥，周恒美

（贵州省检测技术研究应用中心，贵州 贵阳 550000）

乙基多杀菌素（Spinetoram）是多杀菌素（Spinosad）的换代产品，其原药的有效成分是乙基多杀菌素-J（XDE-175-J）和乙基多杀菌素-L（XDE-175-L）的混合物（比值为3 ∶1）[1]，主要用于防治鳞翅目害虫（小菜蛾、甜菜夜蛾）及缨翅目害虫（蓟马）等[2]。树莓拥有世界“第三代水果之王”的美誉，具有清除体内自由基、增叶黄素、抗肿瘤、抗癌、抗炎和促进人体新陈代谢等作用，具有极高的保健功效[3-7]，深受人们喜爱，在对贵州一些树莓生产基地调研时发现，在树莓大规模种植的过程中普遍用到乙基多杀菌素防治虫害[8]，但使用不当会导致该药残留并威胁人们健康。

关于乙基多杀菌素在水体、土壤、蔬菜等基质中的残留分析方法已有不少报道，李刚等[9]、傅强等[10]、牛艳等[11]分别对洛党参中乙基多杀菌素残留、水稻样品中乙基多杀菌素及其代谢物残留、枸杞中乙基多杀菌素及其代谢物残留进行了研究，关于快速测定树莓中乙基多杀菌素残留的方法研究鲜见报道，本文采用QuEChERS 法结合超高效液相色谱-串联质谱法测定树莓中乙基多杀菌素残留，能解决样品基质前处理烦琐、溶剂使用量大的问题。超高效液相色谱-串联质谱法具有检出限低、灵敏度高和检测耗时短等特点，本试验采用基于QuEChERS 的超高效液相色谱-串联质谱法对树莓中乙基多杀菌素进行残留分析研究，为评价与检测树莓中的乙基多杀菌素残留状况及其质量控制提供科学依据，对树莓发展成绿色功能性食品和深加工、产业链延长具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 样品的制备

原料树莓在超市购买3 个品种，分别为红树莓、黑树莓、小蜜莓；选择成熟度为全熟的树莓果，且大小一致、色泽相近、无机械损伤，采用研钵研磨成匀浆，备用。

1.2 材料与试剂

乙基多杀菌素标准品（纯度：99.2%±0.5%，天津阿尔塔科技有限公司）；乙腈、甲醇、乙酸乙酯，均为分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；甲醇、乙腈，色谱纯，德国Merck 公司；十八烷基键合硅胶C18吸附剂（40 ～63 μm）、乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）（40 ～63 μm）、石墨化碳黑（Graphitizing of Carbon Black，GCB）、QuEChERs 萃取盐包（4 g Na2SO4+1 g NaCl）、蔬菜113 盐包（4 g MgSO4+1 g NaCl+1 g Na3C6H5O7+0.5 g C6H6Na2O7），赛默飞世尔科技有限公司；EN 方法净化管（含色素类水果和蔬 菜，150 mg MgSO4+25 mg PSA+2.5 mg GCB）、AOAC 方法净化管（含色素类水果和蔬菜，150 mg MgSO4+50 mg PSA+50 mg GCB），月旭科技（上海）股份有限公司。

1.3 仪器与设备

Agilent 1290-6470 超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪，配有ESI 源美国Agilent 公司；Blixer3 搅拌机，ROBOT COUPA 公司；LT2002 电子天平，天量仪器有限公司；L-550 离心机，湘仪离心机仪器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 标准溶液配制

（1）标准工作液配制。 准确移取浓度为 10.0 μg·mL-1的标准储备液1.00 mL 于10 mL 的 棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度，涡旋混匀，得到浓度为1.0 μg·mL-1的标准工作液；准确移取浓度为 10.0 μg·mL-1的标准储备液50.0 μL 于10 mL 的棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度，涡旋混匀，得到浓度为50.0 ng·mL-1的标准工作液。

（2）溶剂标准工作曲线。移取计算量的标准工作液于1 mL 的容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成乙基多杀菌素-J（XDE-175-J）浓度为0.037 5 ng·mL-1、 0.075 0 ng·mL-1、0.375 0 ng·mL-1、0.750 0 ng·mL-1、 1.500 0 ng·mL-1、3.750 0 ng·mL-1、7.500 0 ng·mL-1； 乙基多杀菌素-L（XDE-175-L）浓度为0.012 5 ng·mL-1、0.025 0 ng·mL-1、0.125 0 ng·mL-1、0.250 0 ng·mL-1、 0.500 0 ng·mL-1、1.250 0 ng·mL-1和2.500 0 ng·mL-1的溶剂标准工作曲线，现配现用。

（3）基质标准工作曲线。移取计算量的标准工作液于1 mL 的容量瓶中，用空白样品提取液定容至刻度，配制成乙基多杀菌素-J（XDE-175-J）浓度为0.0375 ng·mL-1、0.075 ng·mL-1、0.375 ng·mL-1、0.750 ng·mL-1、1.500 ng·mL-1、3.750 ng·mL-1和 7.500 ng·mL-1；乙基多杀菌素-L（XDE-175-L）浓度为0.012 5 ng·mL-1、0.025 0 ng·mL-1、0.125 0 ng·mL-1、0.250 0 ng·mL-1、0.500 0 ng·mL-1、1.250 0 ng·mL-1和 2.500 0 ng·mL-1的溶剂标准工作曲线，现配现用。

1.4.2 样品前处理

①提取。称取5.0 g 制样的树莓样品置于50 mL离心管中，加入10 mL 乙腈溶液振荡提取10 min 后，静置30 min，依次加入1.5 g 乙酸钠、6.0 g 无水硫酸镁，振荡10 min，再4 500 r·min-1离心5 min。②净化。取2.0 mL上清液至装有净化材料（300 mg MgSO4+ 100 mg PSA+100 mg GCB）的10 mL 离心管中，涡旋大约2 min，离心后取上清液到2 mL 离心管中， 16 000 r·min-1离 心5 min 后， 取上清液装瓶供UPLC-MS/MS 检测。

1.4.3 色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus-C18反相色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相A：0.1%甲酸水（含2 mmol·L-1乙酸铵）溶液，B：乙腈；流速： 0.4 mL·min-1；柱温：40 ℃；进样体积：2.0 μL；梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相洗脱梯度

1.4.4 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI），正离子扫描；多反应监测（MRM）；毛细管电压：4.5 kV；雾化器压力：45 psi；干燥气流速：6 L·min-1；干燥气温度：300 ℃；鞘气流速：10 L·min-1；鞘气温度：300 ℃；其他质谱条件见表2。

表2 质谱分析参数

2 结果与分析

2.1 前处理条件的优化

2.1.1 提取溶剂的优化

本实验通过加标回收方式考察了乙腈、甲醇、丙酮、二氯甲烷和酸化乙腈5 种提取剂的提取效果。称取5.0 g 空白树莓样品于50 mL 离心管中，每个处理做6 个平行，加入15 mL 溶剂振荡提取10 min 后，静置30 min，依次加入3.0 g 乙酸钠、3.0 g 无水硫酸镁，涡旋离心后检测。由图1 可知，乙腈和丙酮的提取效率较理想，但是树莓色泽较深，用丙酮提取的色素较多，其颜色明显比其他溶剂提取液深，可能会对仪器造成损害；为了降低敏感性药物的降解，维持溶液酸碱环境的稳定性，实验中常加入甲酸、冰醋酸、氨水等缓冲剂，于是本实验考察了酸化乙腈的提取能力，结果显示，在加入缓冲剂后，回收率有所降低，并不能提高乙腈的提取效率，综上，乙腈为本实验的理想提取溶剂。

图1 不同提取溶剂对乙基多杀菌素的提取效果（n=6）

2.1.2 盐析方法的优化

在目标化合物萃取过程中，为了更好地促进相分离和盐析效应，实验中考察了QuEChERS 初始方法、美国AOAC 2007.01、欧盟EN15662 3 种经典方法中所用的分配盐，初始方法萃取盐包（4 g Na2SO4+1 g NaCl）为1 号盐包、美国AOAC 2007.01 法萃取盐包 （6 g MgSO4+1.5 g NaOAc）为2号盐包、 欧盟EN 15662 法萃取盐包（4 g MgSO4+1 g NaCl+1 g Na3C6H5O7+0.5 g C6H6Na2O7）为3 号盐包，实验结果如表3 所示。使用2 号盐包时XDE-175-J、XDE-175-L 的回收率最好，且精密度最小，可能原因是MgSO4在乙腈中的析出效果最优，同时实验中发现树莓含水量较高，2 号盐包的无水MgSO4较多，能更好地促进有机相和水相的分离，从而提高萃取效率，因此选择2 号盐包作为本实验的盐析方法。

表3 不同盐析方法对回收率的影响（n=6）

2.1.3 净化方法的优化

根据提取化合物的性质和基质特点，选择最优的净化剂，对于减少基质效应、提高被测化合物灵敏度和回收率极其重要。本实验比较了C18、PSA、GCB 的不同组合和用量，以期提高目标化合物提取效率的同时减少基质效应的影响。由图2 可知，4 种净化方法，回收率大小为（MgSO4+PSA+GCB）＞（MgSO4+PSA+GCB+C18）＞（MgSO4+PSA+C18）＞（MgSO4+PSA），组合MgSO4+PSA+GCB 回收率最好，加入C18后回收率下降，可能C18对目标化合物有吸附作用，而单独用PSA 回收率较低，加入GCB 后回收率提高显著，原因是树莓含色素较多，颜色较深，而GCB 能够强烈吸附色素类物质[12]。

图2 不同净化剂对回收率的影响（n=6）

净化剂的用量也会影响回收率，本实验对选出的最优净化剂组合进行了使用量的考察，按照MgSO4∶PSA ∶GCB=3 ∶1 ∶1 的比例考察了总量为250 mg、350 mg、500 mg 和600 mg 的4 组净化剂对回收率的影响。结果如图3 所示，总量为 500 mg 和600 mg 时回收率较好，总量为600 mg 时回收率无明显增长，考虑大批量处理的实验成本，选择总量为500 mg（MgSO4∶PSA ∶GCB=3 ∶1 ∶1）为本实验的净化剂使用量。

图3 净化剂使用量对回收率的影响（n=6）

2.2 方法学评价

2.2.1 基质效应的评价及消除

样品基质中脂类、色素、糖类、可溶性蛋白质、胺类和各种无机盐等经过前处理仍存留在溶液中，有研究表明内源性物质中磷脂对化合物的质谱响应影响较大，较难从样品中清除从而产生严重抑制作用[13-14]，一般用空白基质匹配标准溶液校正和使用同位素内标两种方法来消除或则补偿基质效应，当|ME|＜10%时，ME 可忽略不计；当|ME|在10%～20%时，存在较弱的基质效应；当|ME|＞20%时，存在强基质效应[15]。由表4 可知，XDE-175-J 和XDE-175-L 的ME 值分别为-29.2%、-36.1%，存在强基质抑制效应。

2.2.2 线性关系、检出限、定量线性和基质效应

按照“1.4.1”方法配制标准溶液，在优化好的质谱色谱条件下测定相应的峰面积，分别得到XDE-175-J（0.037 5 ～7.500 0 μg·L-1）、XDE-175-L（0.012 5 ～2.500 0 μg·L-1）的标准曲线方程和线性关系。结果见表4，线性关系良好，相关系数（R2）均大于0.999，采用加标逐级稀释的方法，XDE-175-J 定量限为0.075 μg·㎏-1，XDE-175-L 定量限 0.025 μg·㎏-1，本方法定量限及检出限较低，能较好满足树莓中微量乙基多杀菌素的检测要求。

表4 乙基多杀菌素的线性方程、相关系数、基质效应、检出限及定量限

2.2.3 回收率和精密度

选取黑树莓阴性样品进行加标，其中XDE-175-J加标水平为0.15 μg·kg-1、0.75 μg·kg-1、1.50 μg·kg-1，XDE-175-L 加 标 水 平0.05 μg·kg-1、0.25 μg·kg-1、0.50 μg·kg-1，按照优化条件进行提取和分析。结果如表5，日内平均回收率为92.7%～105.5%，日内变异系数（CV）为2.5%～8.6%；日间平均回收率为94.6%～108.3%，日间变异系数（CV）为2.8%～10.7%。

表5 乙基多杀菌素的回收率和精密度（n=6）

3 结论

本文建立了QuECHERS 结合超高效液相色谱-串联质谱法快速测定树莓中乙基多杀菌素残留检测方法。建立的方法检出限低、灵敏度和重现性好，能够满足树莓中痕量乙基多杀菌素残留的快速、准确、大批量检测要求，为树莓的安全生产和食品安全监管部门提供可靠的技术支持和更多的理论 依据。