陈 波，陈毅群，黄爱军，易 龙

(1 赣南师范大学生命科学学院，江西赣州，341000；2 赣南师范大学地理与环境工程学院，江西赣州，341000)

柑桔碎叶病是柑桔生产中的一种重要病毒性病害，由柑桔碎叶病毒(Citrustatterleafvirus，CTLV)引起，导致患病植株出现矮化，叶片黄化、缩小、边缘破碎等症状，近年在我国湖北、江西、四川和湖南等多个重点柑桔产区均有发生，呈现蔓延趋势，对我国柑桔产业的健康发展构成了严重的威胁[1]。江西赣南是我国脐橙主产区，目前的脐橙种植面积达11.67 万hm2(175 万亩)。“赣南脐橙”多年来一直位居初级农产品地理标志区域品牌价值榜首，在助力贫困山区农民脱贫致富中发挥了重要作用。据研究报道，2017年9月至2018年5月在江西赣南3个果园采集的59份疑似感病的“纽荷尔”脐橙样品，CTLV检出率达23.7%[2]，表明赣南脐橙产业存在CTLV为害的威胁，在生产中应加强防控。

植物受病毒侵染后，植株会表现出一系列的病理变化。如：薇甘菊被薇甘菊萎蔫病毒(Mikaniamicranthawiltvirus，MMWV)侵染后，叶片光合作用的效率降低，表现为叶绿素含量、叶绿素a/b值、净光合速率和光饱和点均降低，超氧化物岐化酶(SOD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性出现显著的变化[3]；墨西哥来檬感染柑桔衰退病毒后，叶片光合能力显著降低，体内丙二醛(MDA)含量和POD活性提升[4]；“赣南早”脐橙被柑桔衰退病毒侵染后，叶片叶绿素a含量、叶绿素b含量、叶绿素总含量和净光合速率降低，MDA含量和胞间CO2浓度提升，叶绿体结构发生畸变[5]。目前，关于CTLV的致病机理尚不清晰。本研究通过分析CTLV侵染对“纽荷尔”脐橙光合作用和酶活性变化的影响，可为深入研究CTLV的致病机理和开展抗病育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验苗为1年生枳砧“纽荷尔”脐橙无病苗，由国家脐橙工程技术研究中心种质资源圃提供。嫁接接种CTLV后置于25 ℃左右的隔离网中培养。共25株，接种18个月后 RT-PCR确认植株都感染了CTLV。所有供试叶片均为植株顶部向下数第3—4枚完全展开叶。

1.2 叶片气孔形态和叶绿体超微结构观察

参考易龙等[6]的方法进行处理。切取供试植株叶片中央叶脉两侧约1 cm ×1 cm大小的叶片组织，喷金处理后利用FEI-450型扫描电镜观察并拍摄叶片气孔形态图。切取主脉两侧大小1 mm×1 mm的小片，按照参考文献[5]的方法处理后，利用透射电镜 FEI Tecnai G2 20 TWIN对叶绿体超微结构进行观察。

1.3 叶片光合参数、MDA含量及酶活性测定

利用TU-1901双光束型紫外可见分光光度计，参照李合生等[7-10]的方法测定供试植株叶片的光合色素和MDA含量，以及CAT、SOD和POD活性。同时，利用LI-6400型便携式光合仪，参照于力等[11]的方法测定叶片净光合速率(Pn)和胞间CO2浓度(Ci)。上述试验均重复3次，采用SPSS12.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 叶片气孔形态及叶绿体超微结构

从电镜扫描结果可看出，健康“纽荷尔”脐橙叶片的气孔状态正常，气孔周围组织饱满、平展；感染CTLV的“纽荷尔”脐橙叶片气孔周围组织皱缩、凹凸不平，气孔萎缩(见图1)。

与健康植株叶绿体相比较，CTLV侵染导致“纽荷尔”脐橙植株叶片叶绿体发生病变，呈现为叶绿体形态结构畸变，外膜出现褶皱、边缘不清晰，淀粉粒变小(见图1)

图1 感染CTLV的“纽荷尔”脐橙叶片气孔形态和叶绿体超微结构(扫描电镜)

2.2 叶片光合参数、MDA含量及酶活性

测定结果发现，与健康植株相比，患病“纽荷尔”脐橙叶绿素a、b和叶绿素总含量分别下降了14.2%、12.1%和17.5%，Pn下降10.8%，Ci上升8.7%，MDA含量增加了12.9%，CAT、POD和SOD活性分别提升了11.3%、27.6%和16.3%，差异均达显著水平(见表1)。

表1 “纽荷尔”脐橙健康与感染CTLV植株叶片的光合参数、MDA含量及酶活性

3 讨论与结论

目前对CTLV的研究多集中在检测技术和病毒分子特性方面[1，12-13]，未见其致病机理相关研究报道。本研究对赣南主栽脐橙品种“纽荷尔”接种感染CTLV后，与对照健康植株相比，发现感病“纽荷尔”脐橙叶片细胞间CO2浓度(Ci)增加，叶绿素总含量、叶绿素a含量、叶绿素b含量及净光合速率(Pn)明显降低，表明CTLV侵染导致“纽荷尔”脐橙的光合作用减弱，植株生理功能受到影响。同时，患病植株叶片MDA含量增加了12.9%，加大了对寄主细胞的致伤程度。通过电镜对叶片叶绿体超微结构进行观察，发现CTLV侵染还导致叶绿体发生病变，呈现为形态结构畸变，外膜出现褶皱、边缘不清晰，叶绿体内淀粉粒变小。这暗示寄主体内代谢强度发生了异常，淀粉粒可能被代谢为能量从而提升寄主抗病能力。本研究结果可为今后进一步研究CTLV的致病机制提供参考。