陈传武，牛 英，付慧敏，刘冰浩，范七君，蒋海兰

(广西柑桔育种与栽培工程技术研究中心/广西特色作物研究院，广西桂林，541004)

“沃柑”是“坦普尔”桔橙和“丹西”红桔的杂交种，属高糖晚熟品种。近些年在我国多地引种栽培，表现出适应性广、抗逆性强、生长势旺、早结丰产、果实外观漂亮、品质优良、果实采收期长等优点。在生产中，“沃柑”单独成片种植时单果种子数达10多粒，与花粉正常的其他柑桔品种混栽时单果种子数可达20粒。“无核沃柑”是通过辐射育种方法从“沃柑”育出的新品种，保留了“沃柑”的优良特性，单果种子数量减少至1～3粒，甚至无籽[1]。近几年，广西多地引种了“无核沃柑”，栽培过程中发现其果实品质优、口感佳、鲜果采摘上市期长，值得试种，但存在保花保果难的问题。种子生长发育过程中产生的激素对着果和果实发育有重要影响，与有核品种相比，无核品种由于没有种子，果实发育期间抵御异常天气等影响因素的能力往往不如有核品种，因而无核变异的产量一般低于有核品种[2]。造成柑桔无核的原因主要分为以下几个方面：雄性不育、雌性不育、自交异交不亲和、胚胎败育等[2-3]。本研究以“沃柑”“无核沃柑”为材料，从花药发育、异交亲和性、胚胎发育等3个方面观察比较两者的生殖发育特点和差异，探讨“无核沃柑”的无核成因，为生产上保花保果技术的开发应用提供理论支持，为进一步探索柑桔无核成因的分子机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 花药发育动态观察

花药发育动态观测：以5～6年生“沃柑”“无核沃柑”为材料，从花蕾露白至开花，每隔2 d采集一次花蕾，以横径相差0.5 mm进行分组，每个等级取5个样(花蕾)。横径小于5 mm的花蕾，进行整蕾冷冻切片；横径大于5 mm的花蕾，剥取花药进行冷冻切片。对切片进行荧光显微观察[4]。

每药花粉粒数量统计：取待开放花蕾20枚，每个花蕾取1枚花药放入2 mL离心管中，共计20枚。加入200 μL蒸馏水，用玻棒碾碎花药，再加入800 μL 0.5% 吐温20溶液，充分振荡，使花粉粒均匀分布于溶液中。用10 μL移液枪吸取2 μL花粉粒悬浮液滴于载玻片上，10×显微镜下观察，统计2 μL悬浮液中的花粉粒数，重复3次。按下列公式计算每枚花药的花粉量：每枚花药花粉量(粒/花药)=(每2 μL花粉粒悬浮液中的花粉粒数×500)/20。

1.2 异交亲和性观察

开花期对“沃柑”“无核沃柑”进行自然授粉(因自身花粉粒极少，未进行自交授粉；果园附近种植有金秋砂糖桔)及分别以“桂橙1号”“琯溪蜜柚”“北京柠檬”为父本人工异花授粉。授粉后7 d和14 d每个处理各取雌蕊10个，FAA固定液固定，苯胺蓝染色法观察花粉管生长情况。具体步聚：(1)将固定保存的雌蕊，用梯度酒精浸洗(70%、50%、30%、蒸馏水，每级15 min)；(2)将雌蕊纵切或横切成若干薄片，置于10%亚硫酸钠溶液(采用无水亚硫酸钠配制)中沸水浴10～20 min；(3)沸水浴后，吸除表面溶液，用蒸馏水浸洗一遍；(4)加入适量0.1%水溶性苯胺蓝染色液浸染20 min以上；(5)用吸管和镊子转移材料至载玻片上，盖上盖玻片适当压展后进行荧光显微观察。成熟期采收果实，统计每果种子数。0.1%苯胺蓝染液配制方法：称取苯胺蓝0.1 g溶于100 mL 0.1 mol/L K3PO4溶液中，装入棕色试剂瓶避光冷藏。

1.3 种子发育动态观察

开花期用“琯溪蜜柚”做父本，分别对“沃柑”“无核沃柑”进行人工授粉。授粉后，每隔两周，每个处理各取5个果实观察种子发育动态。果实横径小于3 cm、种子较小时，切取带种子的果实中柱进行冷冻切片；果实横径大于3 cm、种子较大时，剥取种子进行冷冻切片。对切片进行荧光显微观察[4]。

2 结果与分析

2.1 花药发育动态观察

“沃柑”“无核沃柑”的花朵形态相似：花瓣5片，花瓣长0.7～1.1 cm，花瓣宽0.5～0.6 cm；花丝分离，雄蕊13～18枚，花丝长0.43～0.77 cm，花药长0.2 cm左右；花药浅黄白色，短小，上窄下圆，不饱满较扁平，花药低于柱头，露柱花较多；开花后花药呈淡黄白色，部分花药黄褐色干瘪状，花药大多不能开裂或部分开裂，肉眼难以看到花粉粒。解剖镜下，“沃柑”花药稍饱满，可见少量花粉粒；“无核沃柑”花药更为干瘪，开裂少，可见花粉粒更少(见图1 A1—A2和B1—B2)。“北京柠檬”花药，形态饱满，颜色金黄，成熟时正常开裂并散出大量花粉(见图1 C1—C2)。

“沃柑”“无核沃柑”的每枚花药平均花粉粒数量相当，分别为1 062和1 000粒；每枚花药有4个花粉囊，大多数外侧的2个花粉囊较正常，但形态不饱满、内径小、花粉粒少；内侧的2个花粉囊大多发育不良或不发育；由于花粉囊较小、不饱满，药室壁受挤压程度轻，大蕾期中间层细胞仍留存，药室壁较厚(见图1 A3和B3)。“北京柠檬”的4个花粉囊内径大，为饱满的圆形，且大小均匀，每枚花药平均花粉粒数量达11 775粒；由于花粉囊较大饱满，药室壁受挤压程度重，大蕾期中间层细胞已被挤压破坏，仅留存表皮和内壁，药室壁较薄(见图1 C3)。

“沃柑”“无核沃柑”的花药发育动态较一致。当花蕾横径为2.6～3.0 mm时，花药的4个角隅隆起，花粉囊形态可见，外侧两个花粉囊发育较正常，内侧两个花粉囊较小或不发育；药室壁未发育完全，与花粉囊间组织形态界限不分明(见图2 A1和B1)。当花蕾横径为3.6～4.0 mm时，花粉囊内径进一步增大，花粉母细胞进入减数分裂时期，整体呈团块状黏连；药室表皮层细胞和内壁细胞形态逐渐分明(见图2 A2和B3)。当花蕾横径为4.6～5.0 mm时，四分体壁被胼胝质酶溶解，花粉粒清晰可见，但挨挤成团；药室表皮层、内壁层、2～3层中间层及绒毡层细胞形态分明(见图2 A3和B3)。当花蕾横径为5.6～6.0 mm时，花粉囊内径增至最大，花粉粒分散开来，药室壁内层和中间层细胞开始不均匀条状加厚，进入开花散粉时期(见图2 A4和B4)。从花药的发育动态看，“沃柑”“无核沃柑”的花药都存在发育不良现象，主要表现为花粉囊发育不良或不发育，从而导致花粉囊中花粉粒数量少或无花粉粒产生。从花药的外观形态看，“沃柑”“无核沃柑”的花药均属于败育型花药[5]。

注：Ep-表皮；En-药室内壁；Ml-中间层；Ta-绒毡层；Ms-小孢子。A1—A3为“沃柑”花药大蕾期(A1)、开花期(A2)外观形态和大蕾期(A3)显微形态；B1—B3为“无核沃柑”花药大蕾期(B1)、开花期(B2)外观形态和大蕾期(B3)显微形态；C1—C3为“北京柠檬”花药大蕾期(C1)、开花期(C2)外观形态和大蕾期(C3)显微形态。图1 “沃柑”“无核沃柑”“北京柠檬”花药外观形态和显微形态

2.2 异交亲和性观察

自然授粉时，“沃柑”“无核沃柑”柱头上可见花粉粒极少。人工异花授粉时，“桂橙1号”“琯溪蜜柚”“北京柠檬”的花粉均能在“沃柑”“无核沃柑”柱头上萌发，并经花柱道进入子房室(见图3 A1和B1)，偶见花粉管伸入胚珠(见图3 A2和B2)。

“沃柑”自然授粉及分别以“桂橙1号”“琯溪蜜柚”“北京柠檬”花粉进行异花授粉后，每果种子数较多，分别为12.0、10.0、18.5和16.0粒(见图3 A3)。“无核沃柑”自然授粉及分别以“桂橙1号”“琯溪蜜柚”“北京柠檬”花粉进行异花授粉后，每果种子数较少，分别为0、1.0、1.5和0.5粒(见图3 B3)。从异花授粉花粉管生长情况和果实结籽情况看，“无核沃柑”异花授粉后，花粉管可正常生长进入子房室，其无核发生部位在胚珠，成因可能为雌性不育、受精受阻或胚胎败育。

2.3 种子发育动态观察

“沃柑”“无核沃柑”的子房形态相似，通常10室，每室2～6个胚珠，多为4个。异花(“琯溪蜜柚”花粉)授粉后2周，“沃柑”“无核沃柑”的胚珠大小无明显差异，可见小的胚囊腔，部分胚珠的珠心细胞开始解体(见图4 A1和B1)。授粉后4周，“沃柑”胚珠的大小分化明显，较大胚珠的珠被、珠心进一步发育(以下称为正常胚珠)，较小胚珠则与2周左右时无明显差异(见图4 A2)；“无核沃柑”极少数胚珠进一步发育长大，大部分胚珠的大小与授粉后2周无明显差异，珠心细胞和内珠被进一步解体，在外珠被和胚囊间形成空腔(以下称为异常胚珠)(见图4 B2)。授粉后10周，“沃柑”正常胚珠进一步发育，胚囊腔明显长大，内外珠被、珠心组织和胚囊组织细胞结构明晰(见图4 A3)；“无核沃柑”异常胚珠的珠被、珠心和胚囊明显解体、萎蔫(见图4 B3)。授粉后12周，“沃柑”正常胚珠的胚囊腔直径已达胚珠横径的1/3，且充满游离胚乳核(见图4 A4)，种子质软、种皮光滑(见图4 C1-a)，未发现球形或心形胚(见图4 C1-b)；“无核沃柑”异常胚珠完全萎蔫、皱缩，形成大小0.5 mm左右的微小瘪子(见图4 B4)。授粉后14周，“沃柑”正常发育种子的种皮表面出现明显的棱纹，质地变硬(见图4 C2-a)；胚囊占据整个珠心，珠心细胞被压挤成薄层，合子胚大多发育成球形、心形或较小的子叶胚(见图4 A5和C2-b)。授粉后16周，“沃柑”的合子胚迅速发育成大小不等、质地较软、晶莹剔透的子叶胚(见图4 A6、C3-a和C3-b)。授粉后20周，“沃柑”较大的子叶胚已长满整个胚囊，质地变硬(见图4 C4-a和 C4-b)。授粉后20周，“沃柑”的败育种子大小不一，大的瘪子长宽与正常种子相当，小的瘪子与授粉后两周时的胚珠大小相当(见图4 C5-a)；“无核沃柑”的败育种子普遍较小，大部分肉眼几乎不可见(见图4 C5-b)。

注：A1—A4“沃柑”花蕾直径分别为2.6～3.0、3.6～4.0、4.6～5.0、5.6～6.0 mm时花药显微形态；B1—B4“无核沃柑”花蕾直径分别为2.6～3.0、3.6～4.0、4.6～5.0、5.6～6.0 mm时花药显微形态。图2 “沃柑”“无核沃柑”花药发育动态

注：A1.“北京柠檬”花粉管进入沃柑子房室；A2.“北京柠檬”花粉管进入沃柑胚珠；B1.“北京柠檬”花粉管生长进入“无核沃柑”柱头和花柱；B2.“北京柠檬”花粉管生长进入“无核沃柑”子房室和胚珠；A3.“沃柑”结籽状(a.自然授粉；b.“桂橙1号”授粉；c.“琯溪蜜柚”授粉；d.“北京柠檬”授粉)；B3.“无核沃柑”结籽状(a.自然授粉；b.“桂橙1号”授粉；c.“琯溪蜜柚”授粉；d.“北京柠檬”授粉)。图3 “沃柑”“无核沃柑”异交亲和性观察

“无核沃柑”种子败育的主要表现为早期珠心细胞解体，胚囊、胚珠停止发育，继而引发整个胚珠的萎蔫、皱缩。本研究未能对胚囊的发育进行系统的显微观察，不能判定“无核沃柑”的胚囊是否发育正常，也不能判定雌雄配子是否结合产生合子，因此，不能确定由胚囊败育、受精受阻和早期胚败育中的哪个因素导致了“无核沃柑”的种子败育。

注：OI-外珠被；II-内珠被；NC-珠心细胞；ES-胚囊；E-胚；A1—A6为授粉后2、4、10、12、14和16周“沃柑”种子的发育动态；B1—B4为授粉后2、4、10和12周“无核沃柑”种子的发育动态；C1-a和C1-b为授粉后12周“沃柑”的种子和胚囊；C2-a、C2-b，授粉后14周“沃柑”的种子和幼胚；C3-a和C3-b为授粉后16周“沃柑”的种子和胚；C4-a和C4-b为授粉后20周“沃柑”的种子和胚；C5-a为授粉后20周“沃柑”的败育种子；C5-b为授粉后20周“无核沃柑”的败育种子。图4 “沃柑”“无核沃柑”种子发育动态

3 讨论

3.1 雄性不育

雄性不育是柑桔无核的主要原因，温州蜜柑和脐橙是雄性不育导致无核的代表，“伏令夏橙”“马叙葡萄柚”“无籽瓯柑”“少核红江橙”等的无核和少核也与花粉部分败育相关[2，5-10]。有研究表明，花药外观形态与花粉育性密切相关[5，8-9]。陈力耕把雄性不育的温州蜜柑做母本与雄性正常可育的薄皮细叶甜橙做父本杂交所获得的F1代单株的花粉育性分为正常型、低育型、败育型和退化型；正常型单株的花药形态饱满、颜色金黄，成熟时正常开裂并能散出大量花粉；低育型单株的花药呈短圆形，但形态较为饱满，黄色或淡黄色，可开裂散粉，但花粉量明显少于正常可育型；败育型单株的花药较短小，部分或大部分呈干瘪状态，色泽灰白或略显淡黄，花药大多不能开裂，开裂的也极少散出花粉；退化型单株的花药呈箭头状，花药与花丝基本等粗，似为花丝的直接延长，颜色灰白，毫无花粉粒[5]。胡志勇等发现，花药的颜色与饱满状况基本上能反映该品种花粉的育性：花药败育品种“格伦脐橙”的花药空瘪、呈乳白色，完全没有花粉；细胞质雄性不育(细胞质内遗传物质控制花粉粒败育等雄性个体不育的现象，不育性状可以通过母性遗传传递给后代)品种“国庆一号”温州蜜柑的花药细尖而瘪，呈浅黄色；低育少核品种“华农本地早”桔的花药较饱满，呈淡黄色；育性最强的多核品种“HB柚”的花药饱满、呈金黄色[8]。张迟等研究表明，“有籽瓯柑”花药饱满，色泽金黄，在室内放置2～3 d后花药自然开裂散粉；“无籽瓯柑”花药空瘪，色泽淡黄，在室内放置2～3 d后花药上几乎没有自然散发的花粉[9]。本研究中，“沃柑”“无核沃柑”的花药短小、扁平，开花后呈干瘪状且大多不能开裂，散粉极少，应归属为败育型花药[5]。

从花药的组织细胞形态看，柑桔正常发育的花药，4个药室发育基本同步且大小相对一致，形态圆或椭圆，在花药成熟后，每侧的2个药室之间药隔消失而连成一体，成为具有2个药室的成熟花药。细胞质雄性不育品种“国庆一号”温州蜜柑花药中的4个花粉囊发育不同步，外侧的2个花粉囊发育较快，内侧的发育落后且较小[8]。“蕉柑”花药从发育早期开始就陆续出现一些不正常现象，表现为药室发育受阻，药室发育大小不一、畸形，同侧的2个药囊室之间的药隔不解体等[11]。“格伦”脐橙花药在早期有造孢细胞形成，但在随后的发育过程中造孢细胞降解、退化，没有花粉母细胞形成，最后在花药室中央形成一个空腔，花药壁细胞的分化正常[8]。相关研究表明，花药发育异常现象出现越早，花粉的败育愈加严重[2，11]。本研究发现，与温州蜜柑[8]和“蕉柑”[11]花药的发育类似，“沃柑”“无核沃柑”花药发育前期存在4个花粉囊发育不同步、大小不一的异常现象，后期存在花粉囊小、花粉囊内花粉粒少的异常现象，前期花粉囊不正常发育是导致花药畸形、花粉粒少的主要原因。

3.2 自交异交亲和性

由于部分柑桔品种具有良好的单性结实能力，自交不亲和便成为在毋需杂交的情况下获得无核果实的一个有益性状[2-3]。自交不亲和在柚类品种中较为典型，“琯溪蜜柚”“晚白柚”“HB柚”“水晶柚”具有单性结实能力，在不授粉或自花授粉的情况下能获得无核果实，异花授粉则获得多籽果实；“沙田柚”“酸柚”“无酸柚”不具有单性结实能力，在不授粉或自花授粉的情况下不能获得果实，异花授粉则获得多籽果实[12]。“沙田柚”自交或异交授粉后，花粉管均能通过柱头乳突细胞间隙进入柱头；自交花粉管在花柱1/2左右处停止生长，异交花粉管正常进入胚囊[13]。“琯溪蜜柚”“度尾蜜柚”自交和互交(异花)花粉在柱头上都可正常萌发；自交花粉管进入柱头组织后，大部分在伸长过程出现破裂，伴随有内容物渗出，在花柱道内缘有胼胝质出现，但仍有部分花粉管能正常生长进入子房，并从胚柄处进入胚珠，在珠心组织里观察到胼胝质的积累，其中大多数“琯溪蜜柚”和少数“度尾蜜柚”胚珠的胚囊位置出现强烈的荧光亮点，而互交的胚珠中没有观察到这些现象[14]。本研究发现，与“蕉柑”[15]相似，“沃柑”“无核沃柑”异交花粉管均能通过花柱进入子房室，“沃柑”异交均有籽，“无核沃柑”异交均无籽。

3.3 雌性不育和胚败育

被子植物雌蕊通常由柱头、花柱和子房构成。雌性不育表现为柱头、花柱和子房不发育或发育畸形，胚珠和胚囊发育异常等[16]。胚囊不育是形成无核柑桔的重要原因之一。华盛顿脐橙、伏令夏橙、哈姆林甜橙、马叙无核葡萄柚和温州蜜柑等，在胚囊的大孢子期、二核期、四核期和八核期皆有退化现象[3，6]。“蕉柑”的部分胚珠发育缓慢，珠被不完全包裹珠心，珠心中没有大孢子母细胞存在；大部分胚珠的大孢子发育滞后，花后10 d胚珠和胚囊出现败育迹象，花后20 d败育胚囊明显萎缩[17]。胚败育是指植物授粉受精后，雌雄配子结合形成胚，但由于某些因素，胚中途停止发育的现象[18]。“琯溪蜜柚”Ⅰ型败育种子，授粉后5 d珠心细胞开始出现萎缩，授粉后50 d珠心组织细胞完全萎缩，外珠被发育停止，形成0.5 cm左右的瘪籽；Ⅱ型败育种子，授粉后50 d珠心组织细胞没有萎缩，胚囊继续发育，胚乳开始萎缩，授粉后65 d未见合子胚的生长，珠心组织细胞和胚乳逐渐萎缩，最终成为0.7～1 cm左右的瘪籽[19]。“南丰蜜桔”自交、杂交组合授粉后4周多数胚停滞于合子胚阶段，胚囊瓦解，珠心组织也彼此分离形成空腔，最终胚珠退化消失或仅留存胚珠退化的痕迹；授粉后8周大部分饱满种子的胚发育到心形胚阶段时，胚乳开始瓦解，至成熟期形成大小不一的瘪子[20]。本研究发现，与“琯溪蜜柚”Ⅰ型败育种子一样，“无核沃柑”胚珠形态败育的起始部位也为珠心细胞，不同的是“无核沃柑”的珠被停止发育时期较早，最终形成微小瘪子。