杨嘉妮 朱星枚 袁盼盼 郭凯丽 薛 妙 刘继平 王 川 王 斌

1.陕西中医药大学陕西省中医药管理局中药药效机制与物质基础重点研究室，陕西咸阳 712046；2.陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西咸阳 712046

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占肺癌的85%[1]。化疗及靶向治疗有效，但易复发、易耐药[2-3]。黄精可治疗食管癌、胃癌、直肠癌、肺癌等恶性肿瘤[4-5]，协同化疗或靶向药物治疗NSCLC 时，能显著改善患者生活质量、临床疗效和卡诺夫斯凯计分评分，并减轻毒性，延缓耐药[6]，黄精抗NSCLC 作用的物质基础及分子机制需进一步讨论。黄精成分多样，对应靶点丰富，具有不确定性，仅依靠传统实验方法很难确定其药效成分及作用机制[7]。网络药理学通过构建生物系统网络，选取特定信号节点进行多靶点药物分子设计与分析，可解释药物多组分的协同作用[8-9]。本研究拟通过网络药理学方法探究黄精治疗NSCLC的有效成分及分子机制，并通过分子对接技术及体外实验初步验证。

1 材料与方法

1.1 仪器与药品

人NSCLC 细胞系A549 购自武汉普诺赛。3’-甲氧基大豆苷元（B31005）、黄芩素（C07M10Y87479）、甘草素（C15H1204）购自上海源叶；顺铂（C19PA3741B）购自北京普西唐；CCK-8（EG20201111）购自南京恩晶；Annexin V-FITC/PI（556547）购自BD Pharmingen。全波长酶标仪（TY2021000834）购自美国伯腾；流式细胞仪（Epics XL-MCL）购自BECKMAN COULTER。

1.2 黄精活性成分与疾病靶点收集

检索中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）获得黄精活性成分及对应靶点，口服利用度≥30%，类药性≥0.18。检索人类基因注释、人类孟德尔遗传和治疗靶标数据库收集NSCLC靶点。Version 2.1.0 绘制黄精与NSCLC 交集靶点。

1.3 基因本体（gene ontology，GO）和京都基因和基因组数据库（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析

将交集靶点输入DAVID 数据库进行GO 和KEGG 富集分析，富集结果通过柱状图和气泡图呈现。

1.4 分子对接验证

使用Cytoscape3.6.1 构建“成分-靶点-通路”网络图，Network Analyzer 插件筛选黄精抗NSCLC 核心成分（degree≥5）与核心蛋白，利用AutoDock 4.2 进行分子对接，借助Pymol 实现可视化。

1.5 CCK-8 检测药物抗A549 细胞增殖能力

给予A549 细胞不同浓度的黄精黄酮类核心成分[3'-甲氧基大豆苷元（0、2.22、8.88、3.55×101、1.42×102、5.68×102μg/ml）、黄芩素（0、2.03、4.05、8.10、1.62×101、3.24×101μg/ml）、甘草素（0、6.4、1.28×101、2.56×101、1.024×102、2.048×102μg/ml）][10-12]处理48 h，每孔加入10 μl 的CCK8 溶液，37℃，5%CO2恒温培养3.5 h，读取450 nm 吸光值（OD），细胞生存率=[（OD实验-OD空白）/（OD对照-OD空白）]×100%。每组药设置5 个复孔，每种药IC50重复测定5 次。

1.6 流式细胞术检测药物诱导细胞凋亡能力

给予A549 细胞不同浓度黄精黄酮类核心成分（8.1×101、1.62×102、3.24×102、6.48×102μg/ml）[13]处理48 h，消化、离心后加5 μl Annexin V-FITC 和PI，混匀，避光反应15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。每组实验重复3 次。

1.7 统计学方法

采用GraphPad Prism 7.0 进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黄精活性成分及疾病靶点

TCMSP 数据库获12 个黄精活性成分和85 个相应靶点，与1693 个NSCLC 靶点交集得到43 个共有靶点，见图1。靶点映射得8 个有效成分，即3’-甲氧基大豆苷元、黄芩素、甘草素、5，4’-二羟基黄酮、（2R）-7-羟基-2-（4-羟基苯基）-4-黄酮、谷甾醇、β-谷甾醇和薯蓣皂苷。

2.2 GO 和KEGG 富集分析

GO 富集分析显示，生物过程以RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正向调控、炎症反应、胚胎植入为主；细胞组成以细胞核、细胞溶质、线粒体为主；分子功能主要富集到序列特异性DNA 结合、类固醇激素受体作用、血红素结合等功能上。绘制排名前5 的GO 富集分析结果见图2；排名前20 的KEGG 通路见图3，涉及癌症、细胞凋亡、低氧诱导因子-1、肿瘤坏死因子信号通路等通路。

2.3 分子对接验证

黄精抗NSCLC 核心成分主要是黄酮类成分：黄芩素（degree=34）、3’-三甲氧基大豆苷元（degree=17）、甘草素（degree=10）和5，4’-二羟基黄酮（degree=6）。对应7 个关键靶点：二羟基黄酮与TP53、AKT 激酶、V-Rel 网状内皮增生病毒癌基因同源物A、B 细胞淋巴瘤/白血病-2 基因、细胞凋亡相关半胱氨酸肽酶-3、雄激素受体和低氧诱导因子1A。分子对接展示对接结合能最低者（图4），对接结合能均＜-7.5 kcal/mol（表1），说明配体与受体结合稳健。

表1 黄精中黄酮类化合物与主要靶点对接参数及相应计算结果

2.4 不同黄酮类物质对A549 细胞的IC50

不同浓度3’-甲氧基大豆苷元、黄芩素、甘草素处理A549 细胞48 h，3’-三甲氧基大豆苷元、黄芩素、甘草素IC50分别是6.88×10、7.99 和4.34×10 μg/ml。表明黄精黄酮（5，4’-二羟基黄酮因溶解性差，未进行生物学验证）对A549 细胞有较强的抗增殖能力。

2.5 流式细胞术测定黄芩素诱导A549 凋亡作用

黄精中黄芩素抗NSCLC 作用明显，故流式细胞术选择研究黄芩素诱导A549 细胞凋亡作用，见图5。高剂量黄芩素（8.1×10、1.62×102、3.24×102、6.48×102μg/ml）作用A549 细胞48 h 后，给药组（图5b～5e）凋亡率高于阳性对照组（顺铂）（图5f），差异有统计学意义（P ＜0.05）。

3 讨论

黄精为我国著名药食两用药材，具有抗肿瘤、抗衰老、调节免疫等多种药理作用[14-16]。本文筛选出黄精抗NSCLC 潜在活性成分与张娇等[17]综述的黄精中黄酮化合物的化学结构一致，该类成分被证实具有抗肿瘤增殖、诱导细胞凋亡、抑制肿瘤迁移的能力[18-20]。TP53 是重要的抑癌基因[21]，AKT 过度活化促进NSCLC的侵袭和转移，与患者预后不良密切相关[22-24]。分子对接显示黄芩素、3’-三甲氧基大豆苷元、甘草素、5，4’-二羟基黄酮均与TP53、AKT 具有较好的结合能力，黄精具备多点靶向TP53、AKT 的潜力。B 细胞淋巴瘤/白血病-2 基因、细胞凋亡相关半胱氨酸肽酶-3 则是肿瘤中的凋亡因子[25-27]，黄精中黄酮组分可以通过活化B细胞淋巴瘤/白血病-2 基因、细胞凋亡相关半胱氨酸肽酶-3，诱导NSCLC 细胞凋亡，与化疗药物发挥协同作用。本文以细胞毒性最强的黄芩素为例，通过流式细胞实验证实了高剂量黄芩素可以诱导A549 凋亡，与网络药理学的预测一致，进一步证实了网络药理学的可靠性。实验中亦尝试应用低剂量黄芩素作用A549，其诱导凋亡作用不明显。

总之，本文首次通过网络药理学揭示了黄精抗NSCLC 的物质基础及可能作用靶点。提出黄精中4 个黄酮类物质可以与NSCLC 相关的7 个靶点紧密结合发挥抗NSCLC 作用，具有潜在的抗NSCLC 增殖、诱导NSCLC 凋亡的药理作用。亦为临床合理应用黄精协同化疗药物治疗NSCLC 提供了新的思路。