叶洵，刘子博，张婷，张萌萌，何林，王丹，彭伟，吴纯洁

(成都中医药大学 药学院，成都 611137)

花椒为芸香科植物花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)的干燥成熟果皮[1]。花椒是家庭常用调味品，深受人们的喜爱，最早在春秋战国时期记载使用。花椒含有丰富的挥发油、酰胺等活性物质，在医疗领域也有一定的应用价值，具有温中行气、驱寒、止痛、杀虫等功效，可用于缓解胃痛、呕吐以及腹泻等症状。到目前为止，从科学研究到生产，研究人员和操作人员对花椒的分类依据都不同，叫法各异，这导致了国内花椒的品种和名称的混乱，给生产和销售带来诸多不便，产品质量不一[2-3]。花椒商品依据颜色分类，分为“红花椒”和“青花椒”。其中，“红花椒”的知名产区为四川汉源和茂汶、陕西韩城、甘肃武都等地区，而“青花椒”的知名产区则是四川金阳和洪雅、重庆江津等地区。根据栽培品种分类，主要有汉源贡椒、正路花椒、大红袍、大红椒、小红椒、金阳青花椒、洪雅藤椒等品种[4]。花椒与中药材性质类似，其质量受种植地的经纬度、气候(日照时间、降雨量、干燥度等)以及土壤等因素的影响较大，各地种植的花椒品质差异较大，导致花椒挥发油成分含量也有所不同[5-6]，挥发性香味成分是构成和影响其加工产品质量的重要因素。

指纹图谱技术多用于鉴别道地药材，因此可采用该技术建立花椒挥发油指纹图谱，作为花椒产地鉴别的依据[7]。本研究采用水蒸气蒸馏的方法提取花椒挥发油，建立花椒挥发油GC-MS指纹图谱，分析挥发油化学成分差异，结合保留指数法、聚类分析和主成分分析对不同产地的花椒挥发油成分进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

10批花椒样品具体信息见表1，于2019年8月-10月采集，经成都中医药大学药学院李敏教授鉴定为芸香科植物花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)的干燥成熟果皮。

表1 10批花椒药材名称及来源Table 1 The names and sources of 10 batches of Z. bungeanum

正己烷、无水硫酸钠(分析纯)：购自成都市科隆化学品有限公司；正构烷烃(C10～C25)：购自成都埃法生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

挥发油提取器 四川蜀牛玻璃仪器有限公司；QE-100二两装高速粉碎机 浙江省兰溪市伟能达电器有限公司；Agilent 7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪、Agilent GC-MSD工作站 美国安捷伦公司；Sartorius BP211D电子天平 德国赛多利斯公司；MH-1000调温型电热套 北京科伟永兴仪器有限公司。

2 实验方法与结果

2.1 指纹图谱研究

2.1.1 色谱-质谱条件

气相色谱柱为HP-5MS毛细管质谱柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；载气为氦气(He)，流速为1 mL/min；程序升温：初始温度为50 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至150 ℃，最后以25 ℃/min升至240 ℃；进样量为1 μL，采用分流模式，分流比为30∶1；溶剂延迟5 min；离子源温度为230 ℃；EI电离，电子能量为70 eV；扫描模式为全扫描模式；质谱数据标准谱库为NIST 14.L。在相同实验条件下检测所有供试品，记录样品GC-MS总离子流图。

2.1.2 花椒挥发油提取

按照2020年版《中国药典》四部(通则2204)中挥发油测定法，采用挥发油蒸馏法提取花椒挥发油。具体操作：花椒样品粉碎通过2号、3号筛混合均匀。取粉末适量20 g，称定重量(准确至0.01 g)，置于500 mL圆底烧瓶中，加10倍量水与玻璃珠数粒，连接挥发油测定器与回流冷凝管，放入电热套中缓缓加热至沸腾，并保持微沸约5 h，至测定器中油量不再增加，停止加热，冷却后，读取挥发油体积，并计算供试品中挥发油的含量。加适量无水硫酸钠放于-20 ℃保存过夜。

2.1.3 样品溶液制备

花椒样品溶液：精密吸取挥发油溶液50 μL，加正己烷定容至5 mL，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

正构烷烃溶液：精密吸取C10～C25正构烷烃100 μL，加正己烷定容至1 mL，摇匀，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得0.1 mg/mL正构烷烃溶液。

2.1.4 保留指数(RI)的计算

按照2.1.1项实验条件，吸取花椒样品溶液与正构烷烃溶液进行检测，获得总离子色谱图。根据二者的保留时间，计算待鉴定化合物的保留指数RI，将获得的RI值与文献RI值进行比较。

保留指数的计算公式为：

(1)

式中：tR为保留时间，min；x为供试品化合物；Z、Z+1为待分析物前后两个正构烷烃的碳原子数，即tR(Z)

2.1.5 精密度考察

取1份供试品溶液，按照2.1.1的色谱条件，连续进样6次，进样量1 μL，记录总离子流图。以芳樟醇为参照峰，计算共有峰保留时间RSD值均小于3%，峰面积RSD值均小于3%，表明仪器具有良好的精密度。

2.1.6 稳定性考察

取2.1.3项的供试品溶液，按照2.1.1的色谱条件，于0，2，4，8，12，24 h测定峰面积，以芳樟醇为参照峰，计算共有峰保留时间RSD值均小于3%，峰面积RSD值均小于3%，表明花椒挥发油在24 h内稳定。

2.1.7 重复性考察

取6份同一批次花椒药材粉末，按照2.1.2和2.1.3中供试品溶液的制备方法制备，按照2.1.1的色谱条件，进样1 μL，记录总离子流色谱图。以芳樟醇为参照峰，计算其他峰保留时间RSD值均小于3%，峰面积RSD值小于3%，表明该方法重复性较好，适合花椒指纹图谱的研究。

2.1.8 指纹图谱的建立

2.1.8.1 花椒挥发油成分共有峰确认

GC-MS总离子流图显示：花椒挥发油确定了28～37个峰，共有峰23个，共有峰面积占总峰面积86%以上，以D-Limonene、Linalool、Geranyl acetate、Caryophyllene、γ-Elemene、Humulene、Germacrene D、β-Myrcene、α-Terpineol等为主，具体结果见表2。

表2 10批花椒挥发油GC-MS分析结果Table 2 The analysis results of 10 batches of Z. bungeanum volatile oils by GC-MS

2.1.8.2 指纹图谱的建立

将其导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)，以表1中M2为参照图谱，时间宽度设为0.10 min，多点校正后，生成花椒挥发油共有模式对照指纹图谱，标定23个峰，10批花椒挥发油样品指纹图谱叠加图见图1，对照图谱见图2。

图1 10批花椒挥发油样品指纹图谱叠加对照图Fig.1 The fingerprint spectra overlay reference diagram of 10 batches of Z. bungeanum volatile oil samples

图2 花椒挥发油对照指纹图谱Fig.2 The reference fingerprint spectra of Z. bungeanum volatile oils

各批次花椒挥发油色谱图与对照图谱相似度结果见表3。

表3 10批花椒挥发油对照图谱相似度Table 3 The similarity of reference fingerprint spectra of 10 batches of Z. bungeanum volatile oils

由表3可知，10批花椒挥发油样品的相似度较好，均大于0.9，表明各产地的花椒质量具有较高的一致性。

2.2 不同产地花椒挥发油成分差异研究

挥发油是花椒香气的主要成分，花椒挥发油含量的多少可直接反映花椒香味程度。花椒挥发油含量是反映花椒风味物质的一项重要指标。根据式(2)计算样品中挥发油含量。

(2)

花椒挥发油含量测定结果见表4。

表4 10批花椒挥发油含量的分析结果Table 4 The analysis results of 10 batches of Z. bungeanum volatile oil content

由表4可知，不同产地花椒挥发油含量在2.8%～6.7%之间。不同产地的花椒挥发油含量有差异，且同一产地的花椒挥发油含量也有所不同。其中10批花椒样品中，挥发油含量最多的是茂县花椒，为6.7%，含量最少的是甘肃武都，为2.8%，但均满足2020年版《中国药典》规定的挥发油含量不低于1.5%。

2.3 不同产地花椒挥发油聚类分析

系统聚类分析可根据样品之间的亲疏远近关系进行分类，样品的相似度越大，两者之间的距离越近。适合样品数量较少时的聚类分析，最终输出树状图的聚类结果。根据本实验所得花椒总离子流色谱图，经过化学成分差异分析，分析不同产地花椒样品挥发油的共有峰，并将共有峰峰面积作为花椒挥发油聚类分析的分析对象，将数据导入SPSS 25.0软件，采用瓦尔德法，并用欧氏距离的平方为测度对其进行聚类分析。

系统聚类分析结果见图3。

图3 10批花椒挥发油聚类分析结果Fig.3 The cluster analysis results of 10 batches of Z. bungeanum volatile oils

由图3可知，当类间距离为20时，10批样品分为两大类；H1、H2、H3为一类，其他聚为一类。当类间距离为10时，10批样品被分为三大类：M4聚为一类，H1、H2、H3聚为一类，其余为一类。同一产地的花椒样品挥发油相似度较好，但是亦被聚类分析划分为不同的类别，说明同一产地花椒既具有一致性又存在一定的差异。

2.4 不同产地花椒挥发油主成分分析

主成分分析是一种降维的数据分析方法，根据样品之间的相似度将样品分为若干组。为了找出不同产地花椒挥发油质量差异性，利用SIMCA-P 14.1软件对10批花椒挥发油共有峰峰面积进行主成分分析，以23个共有峰峰面积为变量进行PCA运算，共生成4个主成分，累积贡献率达到97.36%，其中前2个主成分累积贡献率达到83.23%，证明模型有效。以PCA得分和峰面积变量得到Score图(见图4)和Loading图(见图5)。汉源贡椒与茂县大红袍、武都大红袍沿着t[1]轴能明显分开，分为两大类，各组内差异较小，无异常离群样本，说明不同产地花椒挥发油化学成分具有较大差异。根据PCA分析结果，将汉源、茂县和武都3个产地的样品大致分为2组，以23个共有指纹峰峰面积积分值为变量进行PLS-DA分析，得到23个变量的VIP图(见图6)(R2Y=0.927，Q2=0.703，模型有效)，VIP可用来描述PLS-DA分析中变量的变异程度，通常选VIP>1的变量为特征变量。以VIP>1.0为显著影响，共找到10个差异标志物，对其影响显著性排序，分别为峰22>峰23>峰19>峰18>峰10>峰16>峰11>峰6>峰14>峰20>峰1，说明不同产区的花椒挥发油中Germacrene D、(+)-delta-Cadinene、Caryophyllene、Geranyl acetate、Linalool、α-Terpinyl acetate、(E,Z)-2,6-Dimethylocta-2,4,6-triene、trans-β-Ocimene、Nerol和γ-Elemene的含量存在显著差异，可作为不同产地花椒挥发油质量差异的主要共有峰。

图4 10批花椒挥发油Score图Fig.4 The score diagram of 10 batches of Z. bungeanum volatile oils

图5 10批花椒挥发油Loading图Fig.5 The loading diagram of 10 batches of Z. bungeanum volatile oils

图6 10批花椒挥发油VIP图Fig.6 The VIP diagram of 10 batches of Z. bungeanum volatile oils

3 讨论

挥发油作为花椒风味物质的主要成分之一，本研究采用GC-MS技术，测定花椒挥发油总离子流图，并建立指纹图谱。结果表明花椒挥发油相似度大于0.90，证明指纹图谱建立的方法有效。说明不同产地的花椒挥发油既有一定相似性，又存在明显差异。茂县与武都大红袍相似度在0.929～0.992，挥发油含量在2.8%～6.7%，两者跨度较大，可能是由于采收季节时间、保存方式等的不一样导致。聚类分析、主成分分析结果表明不同产地花椒挥发油成分之间存在差异，该结论与课净璇等的研究结果一致[8]。

本研究以当前为主流市场品种的汉源花椒、武都花椒以及茂县花椒的10批样品进行GC-MS指纹图谱研究及相似度评价，共标定了23个共有峰。聚类分析与主成分分析结果发现，汉源贡椒归为一类；茂县与武都花椒二者聚为一类，可能是由于两地的花椒品种均为大红袍，在地理上具有一定的相似性。汉源花椒被列为皇室贡品1000余年，成为中国进贡史长之最，汉源花椒依然是我国品质最好的花椒之一。汉源花椒土壤条件以黄棕壤为主，海拔在1100～1800 m。陇南大红袍花椒主要分布于武都、文县、舟曲等地，陇南武都区光热资源丰富，气候十分适合花椒生长，被冠以“千年椒乡”[9-10]，花椒果实迅速膨大，椒皮鲜红，油腺多而密，麻味重，粒大饱满，香气浓郁，品质特异，被称为“大红袍”。而茂县干旱河谷地区昼夜温差大的独特气候条件，塑造了茂县特有的“大红袍”花椒鲜红透亮、麻味素含量高的特征。武都、茂县花椒产地范围内海拔900～2600 m，土壤为砂壤土，土壤pH值6.5～7.5。茂县与武都地理环境均适宜“大红袍”品种的栽种，故在本实验中采集的大红袍样品出现了聚为一类的现象。

花椒作为高级调味香料和其深加工产品，其挥发性香味成分不仅是作为香原料的重要考察指标，也是构成和影响其加工产品质量的重要因素[11]。目前，花椒质量等级按照林业行业标准(LY/T 1652-2005)、国标GB/T 30391-2019等分级，主要包括感官评价和理化指标评价，其中感官指标包括色泽、气味、味道和果形特征等，理化指标则以挥发油含量为主[12]。本研究建立了基础指纹图谱数据的花椒整体质量评价的方法，可找出质量影响较大的差异性成分，为后续选择指标性成分进行含量测定来评价花椒质量优劣与挥发性成分相关性研究奠定了理论与实验基础。同时不同产地商品的花椒挥发油中Germacrene D、(+)-delta-Cadinene、Caryophyllene、Geranyl acetate、Linalool、α-Terpinyl acetate、(E,Z)-2,6-Dimethylocta-2,4,6-triene、trans-β-Ocimene、Nerol和γ-Elemene的含量存在显著差异，可作为不同产地花椒挥发油质量差异的主要共有峰。

花椒挥发油含有大量同分异构体，在分析过程中仅利用标准质谱库检索进行定性，容易出现误判。对于一些常规GC-MS定性方法难以鉴别的化合物，采用保留指数法可以得到更准确的定性结果[13]，如：保留时间为10.147 min的色谱峰，通过NIST 14.L标准质谱库检索分析为γ-Terpinene、3-Carene，匹配度均为94，经查阅文献[14]，γ-Terpinene的保留指数为1060，3-Carene的保留指数为1007，与实测值进行比较，可知该化合物为γ-Terpinene。通过质谱库检索结果结合保留指数法，可准确性判断花椒挥发油中的化学成分包括顺反式以及α，β，γ等各种同分异构体。

由于花椒产地较多，本研究仅收集到部分产地的花椒品种，研究结果也仅能说明汉源、武都以及茂县花椒挥发性成分的初步特征及差异，后期还需收集足够多代表性的样品，进一步验证该实验结果。本研究建立的花椒挥发油指纹图谱对花椒的质量控制有积极意义，所含挥发性共有成分含量存在明显差异，可为花椒品种选育和其在医药、食品、调味品等行业中的应用提供科学依据。