陈青青，王丛巧，赖钟雄*

（1.福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福建 福州 350002;2.福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002）

铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）为我国传统的名贵药材，栽培利用历史悠久。其主要的药用功能性成分为石斛多糖、生物碱及黄酮类化合物等[1]。近年来，铁皮石斛的野生资源已濒临枯竭，但其离体组织培养产生的原球茎（PLBs）同样含有大量的功能性成分，已知组培原球茎的多糖含量与二年生的野生石斛无异[2]，具有代替其原植株成为药源的可能。植物组织培养可以通过配方、光温等人为干扰其生长与分化[3]，其中温度是影响植物生长的重要因素，昼夜温差（Diurnal Temperature Fluctuation，DIF）更是植物体内物质积累的重要影响因子。该文设想对当前有关昼夜温差对铁皮石斛（组培原球茎）生物量、多糖、生物碱等功能性产物的影响，进行分析总结，以对当前铁皮石斛离体培养原球茎生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用铁皮石斛原球茎材料由福建农林大学园艺学院植物生物工程研究所提供。

1.2 试验方法

选取1 g 生长较一致的圆锥状、淡绿色、尚未分化的原球茎，接种在培养基为1/2MS+50 g/L 土豆+25 g/L 蔗糖+6 g/L 琼脂的培养瓶内，培养基pH 5.4～5.8，接种后放置在光照培养箱内。培养箱昼8：00—20：00、夜20：00—08：00进行温光处理，温度设置25℃/13℃（T1）、25℃/25℃（T2 对照）2 个处理；光照强度2000～2500 lx。材料培养50 d，每隔5 d 随机抽取12 瓶原球茎进行生物量、可溶性多糖和生物碱含量测定，并观察原球茎的形态，对得到的数据进行比较和统计分析。

1.3 测定方法

1.3.1 生物量的计算。每瓶接入1 g 原球茎前整瓶称量，之后每隔5 d 整瓶称量，测到第50 d。生物量计算方法：原球茎的生物量=取样时整瓶质量-接入PLBs 前培养瓶质量。

1.3.2 多糖含量的测定。该次试验根据张萍[4]等的试验方法进行改良，采用石油醚脱脂、Sevage 法除蛋白的多糖测定方法对PLBs 中的多糖含量进行测定。

1.3.3 生物碱含量的测定。生物碱标准曲线的制作参考林艳君[5]的方法。以样品吸光度为纵坐标，石斛碱浓度（通过标准曲线获得）为横坐标，制作标准曲线。整理测定的数据，所得的标准曲线回归方程为：A=0.074X-0.01，R2=0.9364。

生物碱含量（%）=石斛碱浓度×50（稀释倍数）÷400000（单位换算）×100%

1.4 试验统计

每个处理设3 个生物学重复，采用SPSS statistics 17.0软件对试验数据进行分析，方差分析采用Duncan 法，显著性水平P=0.05。采用WPS EXCEL 软件进行制图。

2 结果与分析

2.1 温差对PLBs 形态的影响

培养初期，2 处理铁皮石斛原球茎颜色浅绿偏黄，10 d后颜色开始慢慢转为黄绿色，随着培养时间的增加，慢慢由黄绿转为鲜绿。在T2 对照处理中，原球茎团块第10 d 开始就出现少量分化，原球茎顶部开始变绿，出现细小凸起，随着培养时间的延长，凸起逐渐增大、数量增多，有部分鳞叶生成，25 d 后甚至有部分无根分化苗生成。第35 d 时，观察到原球茎的周围有白色细小绒毛生成。40 d 开始，底部的原球茎出现黄化，颜色逐渐变白，最后变成黄褐色死亡。T1 温差处理下，培养初期与T2 相同都生长缓慢，20 d 以后T1 处理下的原球茎的增殖量始终比同期的T2 大，差异达显著。15～20 d 和30～35 d之间分别出现原球茎数量明显增加。第30 d 时观察到原球茎边缘有部分白色绒毛出现，随着培养时间的延长，绒毛增多。在50 d 的培养周期中，T1 相较于对照处理并未观察到大量分化现象，且随着增殖量的不断增加，基部原球茎变白，最后褐化死亡。综合以上，笔者认为温差处理可能更有利于原球茎的增殖。铁皮石斛原球茎的生长情况见图1。

图1 温差对铁皮石斛PLBs 生长发育的影响

2.2 温差对PLBs 生物量的影响

从铁皮石斛PLBs 生物量变化情况来看，0～10 d 内，2个温度处理下铁皮石斛生物量的增加无显著变化，从20 d开始至第45 d，T1 处理下原球茎的生物量始终都高于T2对照处理，在30～35 d 时，2 个温度处理下的原球茎生物量都有一个显著增高的趋势。40 d 时，T1 处理下原球茎生物量的增加放缓，45 d 后开始下降。而T2 处理40 d 后原球茎的生物量依据保持显著增加趋势。综合以上，铁皮石斛PLBs 在培养初期生物量增长缓慢，T1 处理下30～40 d 是生物量显著增加的时期，且生物量要高于T2 处理（图2）。50 d 时T1 处理生物量的下降可能与基部原球茎的变白褐化死亡有关。

图2 昼夜温差对原球茎生物量的影响

2.3 温差对PLBs 多糖含量及总量的影响

在培养初期，2 个处理的铁皮石斛PLBs 多糖含量变化不大（图3），20 d 开始出现含量显著变化的拐点。T1 处理下铁皮石斛原球茎中多糖含量显著下降，而T2 处理下多糖含量则显著增加且于25 d 时达到最高值，之后逐渐下降。25～35 d，T1 处理的原球茎多糖含量显著增加，且在35 d 时超过了T2 处理。虽然40 d 时有一个显著下降现象，但在35～50 d 期间T1 处理下多糖含量在总趋势上呈现增加。

图3 温差对铁皮石斛PLBs 多糖含量的影响

结合铁皮石斛PLBs 生物量的影响，笔者分析了铁皮石斛的多糖总量，情况如图4。在培养初期，T1 和T2 处理下多糖总量增加缓慢，第0～30 d，PLBs 种多糖的总量表现T1 虽与对照无明显差异，但仍略低于对照。30 d 以后多糖总量也表现出与之前生物量变化趋势相似的显著增加的现象，T1 处理下多糖总量的增幅显著，且在第35 d 时超过了T2 对照处理中的多糖总量。

图4 温差下铁皮石斛PLBs 的多糖总量

多糖含量和总量30 d 后T2 处理开始较大幅度提升；T1 温差处理在30 d 和40 d 后，多糖的含量比T2 一直呈现较高增长的趋势。因此，温差处理更有利于提高铁皮石斛多糖的积累。

2.4 温差对PLBs 生物碱含量的影响

在0～50 d 的培养期内，铁皮石斛PLBs 生物碱含量呈现不断增加的趋势（图5）。在培养前期的0～15 d 内，T1和T2 处理并无明显区别，20 d 后T2 处理的生物碱含量开始高于T1 处理，差异达显著。T2 处理从培养0～50 d，虽然生物碱含量持续增长，但前后差异不显著。总体表明昼夜25℃恒温处理有利于提高铁皮石斛原球茎中生物碱的含量。

图5 温差下铁皮石斛PLBs 的生物碱含量

3 讨论

3.1 温差有利于PLBs 生物量增殖

在一定温差范围内，适当的加大温差有利于植物体内干物质和代谢产物的积累。从铁皮石斛PLBs 生物量变化情况来看，在培养初期，T1、T2 处理PLBs 都增长缓慢，10 d 开始就出现少量分化，顶部变绿，出现细小凸起。但T1 处理20 d 以后的原球茎的增殖量始终比同期的T2大，差异达显著。T1 温差处理30～40 d 是生物量显著增加的时期，且高于T2 恒温处理。严宁等[6]认为铁皮石斛在昼夜温度30℃/15℃条件下栽培可以促进光合作用，而30℃/20℃则可以促进多糖积累。

有研究报道铁皮石斛最佳的生长温度范围在18℃～25℃，最适宜的温差为10℃～15℃[7]，这与该研究结果一致。第30～35 d 时，2 处理都观察到原球茎的周围有白色细小绒毛生成，其可能有吸收功能，利于从培养基或空气中吸收营养。白色细小绒毛与生物量增殖同步，其中原因有待进一步探讨。在50 d 时T1 处理生物量的下降可能与基部原球茎的变白褐化死亡有关。

3.2 温差有利于PLBs 多糖的积累

在一定温差范围内，适当加大温差有利于植物体内干物质和代谢产物的积累。T1 温差处理下，25 d 时PLBs中多糖含量显著降低，这可能与从25 d 开始铁皮石斛PLBs 因增殖量显著增大而引起的生物量提高有关，PLBs内淀粉等多糖降解为可溶性糖，为增殖提供能量。而30 d后T1 温差处理下多糖含量显著增加可能是由于PLBs 颜色开始转绿，增强了白天光合作用，而夜间温度较低降低了呼吸作用，因此促进了多糖的积累。T2 恒温处理下，20 d时多糖含量显著提高，之后不断下降，可能与T2 处理20 d时出现分化情况有关，部分鳞叶的生成促进促进了光合作用，有利于多糖含量的提高，之后分化的加剧，原球茎主要以生长为主，需要消耗大量的能量，使可溶性糖减少，且较高的夜温也促进了其能量的消耗。而相较于对照处理，T1 变温下PLBs 较少出现分化，而以增殖为主，未分化的原球茎相较于有芽分化的原球茎呼吸作用较弱，较低夜温也能使PLBs 中贮藏更多的能量物质。因此，笔者认为温差能促进原球茎的增殖，减少分化，并促进多糖的积累。

多糖是石斛主要的药用成分，很多研究表明，昼夜温差能提升植物体多糖含量。齐国亮[8]研究认为，温差是影响枸杞果实多糖含量的主要气象因子，果实内多糖的含量随着温差的增大而提高。李东[9]也发现低温和温差大是玛咖多糖积累增加的主要原因。张春柳[10]研究认为，25℃/15℃的10℃温差相较于15℃和5℃的温差，更有利于多糖的积累，糖基转移酶基因DoGAUT1 和DoPGSIP6 也在10℃下呈现更高的表达量。严宁等[6]认为，铁皮石斛在昼夜温度30℃/25℃的条件下栽培可以促进光合作用，而在30℃/20℃条件下栽培可以促进多糖积累。艾娟[11]等研究认为，30℃处理的铁皮石斛光合作用最大，20℃处理则有利于多糖积累。以上研究表明，铁皮石斛多糖增殖需要昼夜温差交替（10℃左右）。因此，生产上采用适宜的温差处理铁皮石斛PLBs，以增加多糖有效成分是可取的。

3.3 温差对铁皮石斛PLBs 生物碱含量的影响

不同产地植物中的生物碱含量受温度的影响不同。梁盟等研究认为武陵山区的烤烟中生物碱含量受温度影响不大，而黔中山区的昼夜温差则对烤烟中生物碱含量影响较大[12]。北方保护地条件栽培（1—9月平均气温在3℃～25℃）的铁皮石斛生物碱含量明显高于南方地区[7]。该研究发现原球茎培养初期，2 个温度处理对PLBs 中生物碱含量并无明显影响，随着培养时间的延长，昼夜25℃恒温处理PLBs 中的生物碱含量呈现不断增加的趋势。马绍鋆等[13]在霍山石斛的悬浮培养中发现，生物碱的增长趋势符合次生代谢产物的积累动态与细胞生长的动态平行的相关性，这与该研究中生物碱的变化趋势一致。该研究中，20 d 开始T2 处理下的生物碱含量要高于T1 处理，这可能与20d 后T2 处理下的PLBs 开始分化有关。周建辉[14]研究光照对石蒜愈伤组织及生物碱含量的影响发现，光照培养相较于暗培养，愈伤组织细胞生长较快，呈现一定的分化和不定根，生物碱含量也高于暗培养。这与该研究的结果类似，出现呈现分化的PLBs 生物碱含量更高，并认为这可能与分化后植株光合作用加强有关。该研究中提高多糖含量需要13℃温差，但增加生物碱含量需25℃恒温，之间如何平衡需要进一步加以研究处理。