郭 美，王 兵，周恒花，王 萍△

(上海交通大学医学院附属第九人民医院：1.消化科；2.普外科；3.病理科，上海 200011)

miR-21广泛表达于各种恶性肿瘤中，其表达增高可见于多种恶性肿瘤，包括肺、乳腺、胃、前列腺、结肠及头面部肿瘤等[1-4]。程序性死亡因子4(programmed cell death 4,PDCD4)为一种抑癌基因，在食管、胃、结肠和胰腺等消化道相关肿瘤中表达下降。miR-21通过下调PDCD4表达，干扰细胞凋亡，从而促进肿瘤生长，这一通路已被广泛接受，但关于二者在结肠癌发生和转移中的关系却鲜有报道。本研究分析结肠癌组织中的miR-21、PDCD4的表达情况及其相互关系，并对二者组织表达情况和患者临床病理参数进行探讨，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2010年1月至2013年12月本院经结肠镜检查病理确诊为结肠癌的78例患者为研究对象，其中男58例，女20例，年龄27～85岁，平均(61.65±13.50)岁，所有患者行手术切除、同时留取距离癌灶5 cm以上的正常组织送检。

1.2 方法

1.2.1检测方法

将收集的结肠癌组织及癌旁正常组织放入10%多聚甲醛固定，脱水及包埋后行苏木素-伊红(HE)染色，后由两位本院病理科医师读片。通过免疫组织化学方法检测结肠癌组织及正常组织中PDCD4蛋白表达情况，采用S-P法:常规石蜡切片，二甲苯脱蜡，梯度无水乙醇水化，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次；抗原修复，PBS洗涤3次；滴加3%过氧乙酸阻断组织内源性过氧化酶活性10 min(常温条件下)，再使用PBS漂洗3次；滴加羊血清封闭液，室温孵育30 min；弃去玻片血清，滴加1∶200的兔抗人PDCD4多克隆抗体(美国Abcam公司)，放置于4 ℃冰箱，孵育过夜；次日，PBS漂洗3次，滴加即用型生物素标记的二抗，室温孵育30 min，PBS漂洗3次；滴加即用型SP溶液，室温孵育30 min，PBS漂洗3次；结束后，DAB显色1～5 min，苏木素复染120 s，自来水冲洗10～20 min，晾干，中性塑胶封片，出现棕黄色颗粒即为阳性。每例标本均用PBS代替一抗作阴性对照。

1.2.2实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-21及PDCD4 mRNA

结肠癌组织及癌旁正常组织放置—80 ℃冰箱保存，按照RNA提取盒(加拿大Applied Biosystems公司)，使用qRT-PCR检测mRNA表水平。取5 μL逆转录得到的cDNA，按照反应盒(加拿大Applied Biosystems公司)进行扩增。ACTB为内参。PCR引物如下：miR-21上游引物，5′-TGA GAC TGA TGT TGA CTG TTG AA-3′，下游引物5′-TGT CAG ACA GCC CAT CGA C-3′；ACTB上游引物：5′-CCC AGC ACA ATG AAG ATC AA-3′，下游引物5′-ACA TCT GCT GGA AGG TGG AC-3′。扩增条件为：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环；PDCD4上游引物：5′-AAA GGG AAG GTT GCT GGA TAG-3′，下游引物为5′-CCA CCT CCT CCA CAT CAT ACA-3′。扩增条件为:95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40个循环。每个标本重复3次，取平均值为CT值，ΔCT值=目标基因CT值—内参基因CT值；以正常组织为对照组，ΔΔCT=ΔCT标本—ΔCT对照。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 临床特征及HE结果

78例手术患者中肿瘤占据肠腔一周者5例，占据肠腔周径>1/2的25例，≤1/2的48例；高分化肿瘤9例，中分化肿瘤52例，低分化肿瘤17例；浸润深度：T1～T2共18例，T3～T4共60例；淋巴结转移72例，无淋巴结转移者6例。

2.2 PDCD4在结肠癌组织的表达情况

镜下观察结肠癌组织中PDCD4蛋白主要表达于细胞核及细胞质中。78例结肠癌组织中70例(89.74%)PDCD4蛋白低表达或无表达，而癌旁组织表达呈强阳性。

2.3 结肠癌组织miR-21和PDCD4 mRNA表达情况

与癌旁组织比较，结肠癌组织PDCD4 mRNA表达水平较低，miR-21表达水平较高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 结肠癌组织miR-21和PDCD4 mRNA表达情况

2.4 miR-21与PDCD4 mRNA表达与结肠癌临床病理特征关系

72例(92.31%)结肠癌组织中miR-21表达水平较癌旁组织高，68例(87.18%)PDCD4 mRNA表达水平较癌旁组织低。miR-21和PDCD4 mRNA表达情况在性别、年龄、分化程度、TNM分期中比较，差异无统计学意义(P>0.05)；但二者表达在淋巴结是否转移中比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 miR-21与PDCD4 mRNA表达与结肠癌临床病理特征关系(n=78)

C:结肠癌组织；N：癌旁组织。

2.5 结肠癌组织miR-21和PDCD4 mRNA表达水平的相关性

结肠癌组织miR-21与PDCD4 mRNA无表达相关性(r=0.006，P>0.05)。

3 讨 论

miR-21与炎症、肿瘤密切相关，且参与肿瘤细胞代谢过程，影响多个肿瘤抑制基因及信号通路，其中包括p53、PDCD4[5]、PTEN[6]、RECK[7]、TPM1、Maspin[8]及转化生长因子-β(TGF-β)信号通路和细胞凋亡相关基因[9]等。有研究发现，高表达miR-21的HCT-116结肠癌细胞中，PDCD4、TGF-βR2和PTEN的表达水平均受到明显抑制，而细胞克隆形成能力明显强于正常对照组，在干细胞体外增殖培养中存在类似的现象[10]。

PDCD4蛋白是蛋白激酶B(AKT)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路下游重要的靶点之一。越来越多的研究发现PDCD4蛋白可以通过影响肿瘤细胞增殖、体外转移和抑制凋亡能力发挥其抗肿瘤功能。ZHANG等[11]研究提示PDCD4蛋白下调侵袭相关蛋白AKT和MAP4K1的表达和基因转录活性，激活转移抑制蛋白如E-cadherin和TIMP2的释放。进一步研究表明，高miR-21表达水平会引起PDCD4 mRNA低表达水平。PDCD4低表达者肿瘤体积较大，且较易发生远处和淋巴结远转移[12]，提示miR-21可能通过降低PDCD4的表达促进肿瘤生长和转移。此外，有研究表明miR-21可通过miR-21-PDCD4-AP-1反馈环路增强肝癌细胞的侵袭和转移能力[13]。本研究中发现结肠癌组织中PDCD4 mRNA表达水平较低，且明显低于癌旁组织，而miR-21则呈高表达。但本研究中未观察到二者之间的相关性，可能需要纳入更多的结肠癌病例进行分析。此外，PDCD4是否影响结肠癌细胞的增殖和转移能力，还有待深入研究。另外，本研究观察到淋巴结转移和未转移患者的miR-21和PDCD4 mRNA的表达均存在差异，二者是否与淋巴转移有密切关系或与本研究纳入病例过少有关，有待进一步扩大样本量予以验证。

综上所述，miR-21和PDCD4表达与患者的年龄、性别、肿瘤分化程度、TMN分期等临床病理特征无关，说明在结肠癌发生、发展及转移等过程中，存在多条信号通路，而miR-21作用的PDCD4在其中未必占据主要地位，也有可能与本研究的样本量不足有关，尚待今后进一步观察。本研究证实了miR-21和PDCD4在结肠癌组织中的表达情况及其相应趋势，说明二者和结肠癌的发生相关。