杨 帆，刘春娜

(锦州医科大学基础医学院药理学教研室，辽宁锦州 121001)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DNP)是引起慢性肾衰竭的主要病因之一，也是造成接近30%糖尿病患者最终死亡的原因。据最新统计，在中国已有1.298亿的糖尿病患者，如何防治糖尿病并发症，特别是DNP的发生、发展已成为首要任务[1]。DNP是由于高糖代谢紊乱引起的慢性肾损害，其病理改变表现为肾小球细胞的肥大，肾基底膜增厚及系膜扩张，细胞外基质积聚，肾小球硬化及间质纤维化。其中，肾间质纤维化(kidney interstitial fibrosis，KIF)是引起肾脏疾病进入慢性肾衰竭的最终途径。研究发现，基质细胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1，SDF-1)可通过刺激单核、巨噬细胞向泡沫细胞转化，进而使多种炎性因子表达上调，并促使纤维连接蛋白和胶原的表达上调，同时也造成肾脏固有细胞肥大，最终诱导肾小球硬化和KIF的发生。近年的研究发现，多种炎性细胞因子、炎性酶等促进肾脏组织增殖肥厚、纤维化，参与DNP的进展[2]。新近的研究发现，传统中药三七叶的提取物——三七叶苷(PPD-25-OH)，可能对DNP有预防和治疗作用。PPD-25-OH具有多重药理作用，如抗氧化应激、抗炎镇痛、降血脂和对糖尿病视网膜病变的保护作用，但其对DNP的作用和相关机制方面的研究较少。PPD-25-OH是否通过降低上述炎性趋化因子表达，在DNP中发挥保护作用仍不清楚[3-4]。因此，本研究采用DNP大鼠模型，给予受试药物PPD-25-OH，旨在深入探讨其对DNP的保护作用及可能的机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物

健康SD大鼠，体重200～220 g，由锦州医科大学动物实验中心提供，动物合格证号为SCXK：2014-0010。

1.1.2实验药品

PPD-25-OH提取物通过高效液相法自行提取，提取纯度>98%的单体化合物，分子结构为：20(S)-25-OCH3-PPD。测定SDF-1、环氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)试剂盒均购自美国BOSTER生物制剂有限公司；单核细胞趋化因子(monocyte chemotactic factor，MCP-1)试剂盒及结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1动物分组及给药

取SD大鼠，链脲佐菌素(45 mg/kg)腹腔注射，3 d后测定血糖>16.7 mmol/L定义为糖尿病模型，每日给予高糖、高脂饮食，共12周，诱导DNP模型的建立。取上述造模成功的40只DNP大鼠，每组10只，分为DNP组(生理盐水)、PPD-25-OH低剂量组(PPD-L组，10 mg/kg PPD-25-OH)、PPD-25-OH中剂量组(PPD-M组，30 mg/kg PPD-25-OH)及PPD-25-OH高剂量组(PPD-H组，50 mg/kg PPD-25-OH)，另取10只SD大鼠作为空白阴性对照组(NG组，生理盐水)，灌胃给药4周。

1.2.2血生化指标及肾功能的测定

在给药4周后，各组实验动物采用20%乌拉坦(1 g/kg)麻醉，行颈动脉插管术并取血2 mL，3 000 r/min离心10 min，离心后取上清液，测定血肌酐和尿素氮水平，并用代谢笼收集24 h尿液测定尿蛋白，一方面证明DNP造模成功，另一方面测定PPD-25-OH对糖尿病肾功能改变。

1.2.3测定肾脏指数和病理改变

取血后，各组实验动物均剖取右肾，用冰生理盐水冲洗，滤纸吸干水分后称重，计算肾脏指数=肾质量(mg)/体重(g)，用肾脏指数作为反映肾脏肥厚的量化指标，并间接反映肾纤维化的程度。以4%多聚甲醛溶液固定，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，石蜡包埋，制成4 μm切块备用，进行病理检测。

1.2.4肾组织炎性因子的测定

上述实验结束后，处死各组大鼠，迅速剖取左肾，用冰生理盐水冲洗，4%多聚甲醛溶液固定，PBS冲洗，—70 ℃冻存备用。取一部分肾组织采用ELISA法测定SDF-1、COX-2，用酶标仪于530 nm处测定吸光度(A)值，测定结果以nmol/mg 蛋白表示。另采用Western blot，检测肾组织MCP-1及CTGF蛋白表达，作为反映肾脏纤维化的指标。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 PPD-25-OH对DNP大鼠肾功能及肾脏指数的影响

DNP大鼠出现多饮、多食、多尿的糖尿病典型症状，逐渐消瘦并体重降低，证明DNP造模成功。DNP组血肌酐、尿素氮、尿蛋白和肾脏指数水平明显升高，与NG组比较差异有统计学意义(P<0.05)。与DNP组比较，PPD-L、M、H组血肌酐、尿素氮、尿蛋白和肾脏指数水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2 PPD-25-OH对DNP大鼠肾脏病理改变的影响

病理结果中发现DNP大鼠肾组织均出现明显病理改变，即肾小球变形，肾间质纤维增生，肾小球及肾间质有大量的炎性细胞浸润，证明DNP造模成功。PPD-25-OH干预后，可以抑制DNP模型大鼠肾小球基底膜增厚、系膜基质增多及肾间质纤维增生，肾小球变形不严重，并能减轻肾小球炎性细胞浸润，且PPD-L、M、H组与DNP组比较，损伤明显减轻，见图1。

表1 PPD-25-OH对DNP大鼠肾功能及肾脏指数的影响

A：NG组；B：DNP组；C：PPD-L组；D：PPD-M组；E：PPD-H组。

2.3 PPD-25-OH对DNP大鼠肾组织炎性因子的改变

DNP组SDF-1、COX-2水平升高，与NG组比较差异有统计学意义(P<0.05)。与DNP组比较，PPD-L、M、H组SDF-1与COX-2水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

2.4 PPD-25-OH对DNP肾组织MCP-1及CTGF蛋白表达的影响

DNP组MCP-1和CTGF蛋白表达水平均明显升高，与NG组比较差异有统计学意义(P<0.05)。与DNP组比较，PPD-L、M、H组MCP-1和CTGF蛋白表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

a：P<0.05，与NG组比较；b：P<0.05，与DNP组比较。

A：PPD对DNP大鼠肾组织中MCP-1表达的影响；B：PPD对DNP大鼠肾组织中CTGF表达的影响；1：NG组；2：DNP组；3：PPD-L组；4：PPD-M组；5：PPD-H组；a：P<0.05，与NG组比较；b：P<0.05，与DNP组比较。

3 讨 论

DNP的主要病理改变包括肾脏组织的肥厚、肾细胞的肥大。其中，肾组织的纤维化是DNP最主要的病理特征，因此，防治肾纤维化是预防及治疗DNP及多种肾脏疾病的主要手段和措施[5-6]。

本实验中，DNP大鼠均出现多饮、多尿、体重降低，血肌酐、尿素氮及肾脏指数明显增高，而给予PPD-25-OH治疗后，能明显改善上述症状，并能降低血肌酐、尿素氮和肾脏指数，证明其对肾功能有改善作用。肾脏指数是反映肾脏增大、肥厚的重要指标。DNP组肾脏指数增大表明已出现肾脏肥厚，这是由于肾脏胶原纤维增多，促进肾脏增厚纤维化，肾脏硬度也随之增加，肾脏功能出现异常[7-8]。PPD-25-OH可降低肾脏指数，提示其通过降低肾纤维化，对肾脏肥厚有抑制作用。病理结果也证实，PPD-25-OH干预后，肾组织病理改变减轻，且可抑制大鼠肾小球基底膜增厚，抑制肾间质纤维增生。该结果进一步验证了DNP大鼠造模成功，也提示PPD-25-OH能通过改善肾功能，减轻肾组织肥厚，对DNP有治疗作用。

实验结果证实PPD-25-OH能降低肾组织中炎性因子SDF-1与COX-2蛋白水平。SDF-1对肾小球系膜细胞具有趋化作用，COX-2是生成炎性介质前列腺素的重要酶，在DNP肾脏组织肥厚和纤维化的病理性重构中，二者均发挥了趋化促进作用[9-10]。MCP-1是单核巨噬细胞的特异性趋化因子，可由体内多种细胞产生，当肾组织受到刺激，特别是炎症刺激后，MCP-1 mRNA及蛋白质表达水平随肾纤维化加重而增高，MCP-1通过趋化单核巨噬细胞在肾小管间质聚集，介导肾间质炎症及肾间质纤维化，从而促进DNP纤维化的发展[11]。另外，CTGF是促进肾脏和多种器官发生纤维化的最主要细胞因子，其水平高低能直接反映纤维化的程度。CTGF的过度表达可激活其下游信号分子和激酶，促进肾脏组织纤维化和肥厚，从而导致肾脏病理性重构[12]，PPD-25-OH降低MCP-1和CTGF的表达，提示其通过抑制炎性纤维化因子，进而抑制DNP的纤维化起到对肾脏的保护作用。

综上所述，PPD-25-OH可有效抑制DNP肾脏增殖肥厚，进而改善肾功能，改善肾间质纤维化，对DNP大鼠肾脏组织具有保护作用，其保护作用与抑制炎性因子SDF-1与COX-2的水平、降低MCP-1与CTGF蛋白表达有关。