王明湖， 连瑛， 李雅颖， 谢媛， 徐力斌， 汪国文， 吴愉萍*

(1.宁波市农业农村绿色发展中心，浙江 宁波 315012； 2.浙江省城市环境过程与污染控制重点实验室中国科学院宁波城市环境观测研究站，浙江 宁波 315830； 3.杭州弥奥科技有限公司，浙江 杭州 310007； 4.奉化区大堰镇农业农村办公室，浙江 宁波 315509； 5.余姚市银农农业生产资料商店，浙江 宁波 315400)

草莓在全球经济作物中具有非常重要的地位，近年来，我国草莓产业发展迅速，种植面积和产量均居世界第一位[1]，草莓已经成为最受老百姓欢迎的季节性水果之一，草莓产业的健康发展也是农产品质量安全的重要保障内容。炭疽病是一种高温、高湿型真菌性病害，为草莓最主要的病害之一，通常南方地区发生较为普遍，主要发生在草莓生产初期，常造成25%～30%减产，严重影响草莓的产量和品质[2]。在炭疽病防治过程中农民大量使用化学药剂，使草莓成为安全风险等级较高的农产品[3-4]。

微生物菌剂是一种防控草莓炭疽病的新的绿色防控技术手段，可以有效减少化学药剂的使用，增加土壤微生物含量[5]，提高土壤养分有效性[6]，促进草莓植株健康生长[7]，符合国家倡导的绿色发展理念。本文以5种不同的微生物菌剂为研究对象，在大棚草莓种植中参照绿色食品标准施用农药和肥料，研究在减少化肥和农药使用的前提下，不同微生物菌剂对草莓炭疽病的抑制作用，进而为草莓炭疽病的绿色防控提供对策。

1 材料与方法

1.1 材料

供试草莓品种为红颜(红颊)，属高感炭疽病品种[8]。

试验地为浙江省宁波市北仑区一大棚草莓种植基地，地理坐标为121°46′23.49″E，29°51′41.00″N。

土壤pH 4.46，有机质含量为31.0 g·kg-1，水解性氮含量为234 mg·kg-1,有效磷含量为134 mg·kg-1,速效钾含量为453 mg·kg-1。

供试的5种微生物菌剂由杭州弥奥科技有限公司研制，其中4种为纯菌株，代号分别为F2(枯草芽孢杆菌，Bacillussubtilis)、F8(多黏芽孢杆菌，Bacilluspolymyxa)、F11(解淀粉芽孢杆菌，Bacillusamyloliquefaciens)、F12(贝莱斯芽孢杆菌，Bacillusbelais)；1种为复合菌剂，由上述4种菌株混合而成。

1.2 处理设计

试验设置CK(不施微生物菌剂)、F2、F8、F11、F12和F(由F2、F8、F11、F12菌株组成的复合菌剂)6个处理。菌剂用量：晒干发酵羊粪+6.7%液体菌剂拌匀作基肥使用，每小区施用羊粪15 kg，菌液1 L；移栽时每小区0.5 L菌液稀释30倍浇根；CK组用自来水代替菌液。每个处理重复3次，采用随机区组设计。每个小区面积为16 m2。所有小区施肥、用药均相同，施肥按照NY/T 394—2013《绿色食品 肥料使用准则》，用药按照NY/T 393—2013《绿色食品 农药使用准则》。

7月6日施入菜籽饼和石灰氮，翻耕后灌水，覆盖地膜开始高温闷棚。8月16日施入其他基肥后开沟整地，整好地后，按照试验设计，条施经过微生物菌剂或自来水(CK)处理的羊粪。9月11日草莓移栽定植。9月12日按试验设计方案浇施不同菌液或自来水(CK)。10月9日第二次浇施菌液。11月1日草莓覆盖地膜。11月7日盖大棚膜。11月15日蜜蜂进棚，草莓进入始果期。12月29日第一批草莓成熟。次年4月3日草莓采摘结束。草莓达到上市标准后采摘，并记录每次产量。

1.3 测定参数与方法

密切关注移栽后草莓炭疽病的发病和致死情况，统计各处理草莓病死植株数量。

采集处理前(8月15日)、第二次施用菌液后第3天(10月12日)和挂果后期(次年3月14日)各处理土壤样品，提取土壤菌群DNA，采取高通量测序的手段，进行真菌和细菌群落结构的分析。分别于处理前(8月15日)、始果期(11月13日)、挂果初期(12月5日)、盛果期(次年1月22日)和挂果后期(次年3月14日)采集微生物菌剂处理土壤混合样品和CK处理样品，测定pH值、有机质、水解性氮、有效磷和速效钾含量。

按照操作说明书进行土壤菌群DNA的提取，使用Power Soil DNA提取试剂盒(美国MoBio)从0.1 g的土壤样品(冷冻干燥)中提取DNA。所得的DNA最后用100 μL的无菌水洗脱到2 mL离心管中，后保存于-20 ℃以备后续分析。MiSeq高通量测序，细菌16S rRNA与真菌ITS分别用515F和907R、ITS1F和ITS2进行扩增，并在Illumina MiSeq平台(300×2)上测序。测序数据已提交在BioProject PRJNA 558591的NCBI序列数据库(SRA)中。pH参照NY/T 1377-2007《土壤pH的测定》方法测定；速效钾含量参照LY/T 1234—2015《森林土壤钾的测定》方法测定；水解性氮含量参照LY/T 1228—2015《森林土壤氮的测定》方法测定；有效磷含量参照NY/T 1121.7—2014《土壤检测 第7部分：土壤有效磷的测定》方法测定；有机质含量参照NY/T 1121.6—2006《土壤检测 第6部分：土壤有机质的测定》方法检测。

1.4 数据处理

试验数据采用DPS V 9.01软件进行整理并绘制表格，使用SigmaPlot 10.0绘制图形。高通量测序的原始双端数据采用Fastq进行数据质控查看、过滤掉低质量的测序结果；再用Usearch进行拼接、修剪到预期的片段大小(300～385 bp)，然后使用USEARCH v6.1.544删除嵌合体。使用QIIME 1.9.1和UNITE数据库(12.11)以及BLAST方法，在97%的相似性下，按照Open reference方法来提取操作分类单位(operational taxonomic unit，OTU)。利用R语言v 3.6.0(R Core Team，2019)中“vegan”程序包对细菌和真菌群落进行主坐标分析(PCoA)。

2 结果与分析

2.1 不同微生物菌剂对炭疽病的防治效果

由图1可知，不同微生物菌剂处理下草莓炭疽病致死情况显著不同。与CK相比，F2、F8和F11处理组草莓因炭疽病死亡数显著增加。F12处理与CK处理草莓死亡数无显著差异。F处理草莓死亡棵数比CK处理显著减少，死亡率降低。复合菌剂的使用能够有效抵抗草莓炭疽病的发生，进而增加草莓产量，获取相对较高的经济收益。单一菌剂对草莓炭疽病没有防治效果，但复合菌剂可以显著降低草莓炭疽病的发病致死现象，这可能和复合菌剂的协同作用有关。该复合菌剂中的微生物可能在环境中发挥了正向作用，改善了土壤微生物的群落结构，提高了土壤养分的有效性，进而增强了作物的抵抗力。或者复合菌剂的微生物在环境中占有绝对优势，有效抑制了炭疽病菌的生长。具体是哪一种机制产生作用，还有待进一步研究。

不同处理间没有相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图1 不同处理下草莓炭疽病死亡数及死亡降低率

2.2 不同处理对土壤微生物生物量和群落结构的影响

不同处理土壤DNA提取含量在60.97～88.53 ng·μL-1(图2)。无论是10月12日还是次年3月14日，不同处理间土壤DNA提取含量均无显著差异。土壤DNA含量可以表征土壤微生物生物量[9]，在本试验中，不同微生物菌剂处理后，土壤微生物生物量无显著差异。

细菌主要以变形菌门(相对丰度29.7%)、拟杆菌门(相对丰度11.8%)和绿弯菌门(相对丰度11.0%)为主，微生物菌剂处理后能显著增加厚壁菌门的相对丰度(图3)，这与微生物菌剂为厚壁菌门一致。主坐标分析表明，微生物菌剂处理能显著改变土壤细菌群落结构，使用微生物菌剂后土壤细菌群落明显改变，但是同一采样时间不同微生物菌剂处理之间差异不显著(图4)。真菌主要以球囊菌门(相对丰度36.7%)和子囊菌门(相对丰度17.4%)为主(图3)。主坐标分析表明，不同处理之间及不同采样时期之间土壤真菌群落差异不明显(图4)。微生物菌剂的添加能对土壤的细菌群落产生显著影响，但是对真菌的作用不明显。

P为供试地块微生物菌剂处理前(2018年8月15日)采集的土壤样品，图3、4同。图2 不同处理土壤DNA提取含量

1st为10月12日采集的土壤样品；2nd为3月14日采集的土壤样品。图3 不同处理细菌和真菌的群落组成

菌剂处理前样品采集为8月15日；第一次样品采集为10月12日；第二次样品采集为3月14日。图4 不同处理细菌和真菌的主坐标分析图

2.3 微生物菌剂对土壤养分含量的影响

整个草莓生长周期，无论是CK组还是微生物菌剂处理组，土壤中养分含量丰富，整体变化趋势基本一致(表1)。微生物菌剂处理后的土壤pH、水解性氮、有效磷和有机质4个指标均略高于CK组。速效钾含量则呈负效应，微生物菌剂处理后的土壤较CK组明显降低，可能与土壤本身速效钾含量过高，属于富钾状态有关，菌剂处理后调节土壤中钾含量，向更有利于植物和微生物利用方向转变有关。

表1 微生物菌剂对土壤营养成分的影响

3 小结

本研究中，由F2、F8、F11、F12菌株混合而成的复合微生物菌剂显著降低了草莓炭疽病发病植株死亡率。不同微生物菌剂处理对土壤微生物生物量和真菌的群落结构影响不大，但显著影响了土壤细菌的菌落结构，增加了厚壁菌门的相对丰度。选择适宜的微生物菌剂可以作为草莓绿色防控的一种手段，进而减少农药用量。