徐 倩 郑萍萍 惠灿灿 陆雅婷 王 林 陈明卫 刘建军 邓大同

自身免疫性甲状腺疾病（autoimmune thyroid disease，AITD）属于一种器官特异性自身免疫性疾病，是育龄期妇女最常见的甲状腺疾病[1]。甲状腺自身免疫（TAI）的主要特征是自身免疫性甲状腺抗体如抗甲状腺球蛋白抗体（TgAb）、抗甲状腺过氧化物酶抗体（TPOAb）水平升高。研究表明，TPOAb或TgAb在妊娠期妇女中的阳性率达2%～17%[2]。文献证实，患TAI的女性在妊娠过程中发生妊娠期糖尿病、妊娠期高血压、甲状腺功能异常等风险增加，对妊娠结局及后代发育产生不良影响[3-4]。而妊娠前女性患有TAI一般临床症状较隐匿，无特异性，易被忽视。近年来有研究认为女性孕前筛查自身免疫性甲状腺抗体具有重要意义[5]。本实验旨在建立实验性TAI模型，初步探讨孕前TAI对后代学习记忆能力的影响及可能的机制，进一步分析孕前筛查自身免疫性甲状腺抗体的必要性。

1 材料和方法

1.1 实验动物 所有动物实验均遵循《安徽医科大学实验动物管理和使用指南》。SD大鼠（4～5周龄，200～250 g）购自安徽医科大学实验动物中心。SD雌鼠适应性饲养7天，随机分为对照组（CON组）和甲状腺自身免疫组（TAI组），每组8只。

1.2 试剂及仪器 猪甲状腺球蛋白（pTg）、完全弗氏佐剂（CFA）、不完全弗氏佐剂（IFA）均购自美国Sigma公司；TgAb、TPOAb测定试剂盒均购自美国西门子医学诊断股份有限公司；形态学图像分析系统（Image-ProPlus 6.0）来自美国MEDIA CYBERNETICS 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 TAI动物模型制备 参考文献[6]制备动物模型，将pTg与生理盐水混合溶解成2 mg/mL溶液，与CFA按照1∶1体积比混合，反复研磨至完全乳化。以每只大鼠pTg100 μg多位点皮下注射进行初次免疫。CON组注射等量不含pTg的CFA乳化剂。每周1次，从第3周至第6周，用IFA代替CFA制备乳液，其余操作方法同前。7周后，随机将3只雌鼠与1只未经处理的SD雄鼠合笼交配。观察到阴道黏液栓的早晨为胚胎第0天（第0天），分娩日设定为后代生后第0天。本实验经实验动物伦理审查。

1.3.2 血清抗甲状腺抗体测定 造模结束后，雌鼠采用眶静脉采血约1 mL，高速离心机3000 r/min，离心15 min，分离血清。采用电化学发光免疫分析（ECLIA）检测血清TgAb和TPOAb水平。

1.3.3 莫里斯水迷宫实验（MWM） 采用MWM实验测试学习记忆能力。每组随机抽取8只生后30天的仔鼠进行MWM实验。水池直径180 cm，水深30 cm，水温（22±2）℃。分为4个象限。本实验选择第3象限放置一个顶面为10 cm×10 cm的平台，低于水面2 cm。MWM分为两个部分：一是定位航行实验，共连续进行5天，每天下午进行4次测量。仔鼠面向池壁分别从4个不同象限入水。找到平台后，在平台上停留20 s，休息60 s，然后从下一象限随机入水。记录仔鼠找到平台的时间，即逃避潜伏期。如果仔鼠入水后60 s内找不到平台，操作者将帮助其上平台，即本实验中的最大逃避潜伏期为60 s。二是空间探索实验，在实验开始后的第6天拆除平台，将仔鼠从第1象限面向池壁放入水中，观察并记录每只仔鼠90 s内在第3象限内滞留时间及穿过原始平台的次数。

1.3.4 海马组织标本制备 仔鼠行为学实验结束后次日，经水合氯醛麻醉后，解剖仔鼠，暴露心脏，剪开右心耳，自心尖部快速滴入生理盐水，至流出液清澈，肝脏变白，继续注入4%的多聚甲醛灌注固定，断头取脑，留取新鲜脑海马组织，4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋，切片。

1.3.5 苏木精伊红染色（HE） 仔鼠脑海马组织石蜡切片经二甲苯脱蜡、复水后，进行苏木精染色，盐酸乙醇返蓝，伊红水溶液染色，再经梯度乙醇脱水，二甲苯透明处理，最后封片。光学显微镜下观察并拍摄图片。

1.3.6 尼氏染色 取仔鼠海马组织切片，常规脱蜡至水，用1%甲苯胺蓝水溶液进行染色，染色20分钟后冲洗多余的染色，乙醇分化、脱水，二甲苯透明后中性树胶封固。光学显微镜下观察并拍摄图片。

1.3.7 免疫组化染色 免疫组化法检测成熟神经元核蛋白（NeuN）和突触相关蛋白（SYN）的表达。仔鼠海马组织切片常规脱蜡至水，浸入柠檬酸盐修复液500 mL微波修复，水浴冷却。滴加3%H2O2孵育20 min，PBS缓冲液漂洗3次后，滴加适当稀释的NeuN、SYN一抗，4℃孵育过夜。PBS漂洗3次，分别滴加二者相应抗小鼠/兔二抗。再次PBS漂洗3次，加入DAB显色液。苏木精复染、蓝化，梯度乙醇脱水，二甲苯透明、封片，光学显微镜下采集图片，分析平均光密度值。

1.4 统计学分析 所有图表均使用GraphPad Prism 7.04制作。数据分析采用SPSS 23.0统计学软件进行处理，计量资料以（）描述，正态分布的计量资料采用两独立样本t检验进行组间比较，不符合正态分布采用非参数秩和检验。重复测量数据采用重复测量方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组雌性大鼠血清抗体水平 TAI组大鼠血清TgAb、TPOAb水平均显著高于CON组，差异具有统计学意义（P＜0.05），见图1。

2.2 行为学指标

2.2.1 定位航行试验 数据显示，在定位航行测试中，各组仔鼠到达平台的逃避潜伏期均表现逐渐缩短。第5天，TAI组仔鼠到达平台的潜伏期与CON组相比显著延长（P＜0.05），见图2A。

2.2.2 空间探索试验 结果发现，TAI组仔鼠在平台所在象限的滞留时间明显短于CON组仔鼠（P＜0.05）；TAI组仔鼠穿越平台次数显著低于CON组仔鼠（P＜0.05），见图2B。

图2 各组仔鼠MWM实验结果

2.3 海马组织形态 HE染色观察到各组海马组织结构CA1区域结构完整，神经元形态规则，细胞排列紧密，细胞内结构多而清晰，无水肿。尼氏染色观察到CA1区神经元完整，排列致密，细胞核大而圆，胞浆呈深蓝色，细胞质内有丰富的尼氏小体，锥体层细胞排列整齐，呈锥体或球形，胞浆呈深蓝色，未观察到明显的神经元丢失。TAI组和CON组之间没有显著差异，见图3。

图3 各组仔鼠海马组织CA1区神经元HE染色和尼氏染色结果

2.4 海马组织NeuN、SYN表达情况 ①各组仔鼠海马NeuN表达水平：与CON组相比，TAI组仔鼠海马组织CA1区NeuN阳性细胞的平均光密度显著降低（P＜0.05），提示NeuN蛋白表达降低，见图4A。②各组仔鼠海马 SYN表达水平：与CON组相比，TAI组仔鼠海马组织CA1区SYN平均光密度显著降低（P＜0.05），提示SYN蛋白表达降低，见图4B。

图4 各组仔鼠海马组织CA1区神经元NeuN、SYN蛋白表达结果

3 讨 论

甲状腺自身免疫是育龄期妇女甲状腺功能减退的最常见原因。研究证实，妊娠期甲状腺功能减退对子女的神经认知功能发育产生不良影响[7]。也有文献认为，单纯自身免疫性甲状腺抗体阳性可能直接导致后代认知功能损害[8]，但目前仍存在争议。因此，孕前及孕期对甲状腺相关指标如甲状腺功能、自身免疫性甲状腺抗体包括TPOAb的筛查和防治是当前优生优育领域的热门课题。本项研究通过建立TAI动物模型探讨孕前TAI对后代认知功能的影响，进一步分析孕前筛查TPOAb的意义。

该研究通过pTg免疫SD雌鼠，建立了孕前TAI的动物模型。学习记忆是神经认知功能的重要部分。MWM是一种经典的行为实验方法，可以很好地评估啮齿动物的学习记忆能力。结果显示，TAI组后代在目标象限停留时间和跨越平台次数与对照组相比显著降低，这表明孕前TAI可能会导致后代学习记忆障碍。众所周知，海马体在学习记忆中起着重要的作用，其中CA1区是关键区域，海马体发育障碍可导致人类认知功能的损害。因此，本研究从海马神经元形态、数量和功能等方面对后代海马CA1区进行了初步探索。NeuN是神经元成熟的重要标志，其阳性表达量与神经元的功能状态密切相关。突触是神经元信息传递、加工和储存的重要组织，SYN蛋白的表达影响突触小泡的运输能力，与学习记忆密切相关。本研究通过HE染色和尼氏染色发现仔鼠海马形态结构没有显著差异。但与对照组相比，TAI组海马CA1区NeuN和SYN阳性细胞的表达降低。

以上数据表明，孕前TAI对后代认知功能及海马发育会产生不良影响，但具体机制尚不清楚，有待进一步研究。甲状腺激素是调控脑发育的关键性激素，对胎儿脑发育过程中神经元的成熟、突触的形成及功能等起着重要的作用。TAI与甲状腺功能异常的发生密切相关，TPOAb是反映TAI的特异性指标，参与甲状腺细胞的损伤，是甲状腺功能减退的危险因素。且随着妊娠进展，孕妇和胎儿对甲状腺激素需求增加，TPOAb阳性的母体自身促甲状腺激素（TSH）水平会逐渐增高，最终可出现亚甲减甚至甲减[9]。因此我们推测，孕前TAI对后代认知功能及海马神经元发育的损害，其机制可能与TAI导致母体甲状腺激素异常有关。也有一些研究认为，自身免疫性甲状腺抗体阳性的母体，即使甲状腺功能正常，也会导致后代认知发育障碍，可能与以下三方面机制有关：妊娠期自身免疫性甲状腺抗体阳性是产后甲状腺炎的主要原因，与产后抑郁有一定的关联[10]，可能会对后代认知发育产生不良影响；TPOAb能通过胎盘，可导致胎儿短暂性TSH水平升高，胎儿自身甲状腺激素不足而影响胎儿脑发育[11]；妊娠期TPOAb阳性的母亲，其后代感觉性神经性听力缺陷的发病率明显升高，可能对认知发育产生不良影响[12]。但目前甲状腺功能正常的TAI对后代发育的影响尚存在争议。这项研究也存在一些局限性，未来对于孕前TAI对后代认知功能影响及机制的深入研究，应注意以下几点：首先，母体孕前及妊娠过程中自身免疫性甲状腺抗体阳性的滴度和甲状腺激素水平对后代认知功能的发育可能很重要，应控制更严格的条件，如分离自身免疫性甲状腺抗体、控制甲状腺激素正常水平等。其次，为了更全面地评价后代的认知功能，应开展避暗测试、恐惧条件反射测试等多项行为实验，以及后代远期认知功能的测试。

综上所述，孕前TAI对仔鼠认知功能会产生不良影响，建议孕前筛查自身免疫性甲状腺抗体，这与2019年我国《妊娠和产后甲状腺疾病诊治指南》第2版意见一致，且该指南指出对于孕前甲状腺功能正常而TPOAb或TgAb阳性的妇女在妊娠后,应注意监测血清TSH水平,推荐每4周检测一次至妊娠中期末[2]。对于育龄期女性尽早发现甲状腺相关疾病并给予适当的治疗，对改善妊娠结局及避免对后代的不良影响具有重要意义。