范 杰 谢宇平 惠培林 马 薇 王金凤 苏晓艳 陈雪萍王旭斌 郭 斌 赵 媛

1）甘肃省人民医院睡眠医学中心，甘肃 兰州 730000 2）甘肃省睡眠临床医学研究中心，甘肃 兰州 730000

失眠分为继发性失眠和原发性失眠（primary insomnia，PI）。PI是指以睡眠障碍（难以入睡和/或维持睡眠困难或睡眠后精力未恢复）为几乎唯一的症状，每周至少出现三晚睡眠困难，时间在3个月以上，并具有临床意义的苦恼及社交、职业或其他功能的损害；排除由其他睡眠与精神/心理障碍以及躯体的疾病、酒精或药物等导致的失眠［1］。相关研究发现PI患者有家族聚集现象［2］，BEAULIEU-BONNEAU 等［3］对953例成人的调查中，35%报道至少有一个一级亲属有过或者罹患失眠，提示原发性失眠具有遗传特征［4］。

五羟色胺（5-hydroxy tryptamine,5-HT）的睡眠调节作用已有很长的研究里程［5-6］，其功能是促觉醒，抑制 慢 波 及 快 动 眼 睡 眠［6］。5-HT 转 运 体（5-HT transporter，5-HTT）位于突触前膜，它通过对突触间隙中5-HT 的再摄取来调节作用于突触后的5-HT 浓度，对5-HT 的功能发挥起关键作用。神经肽S（neuropeptide S，NPS）及神经肽S受体（neuropeptide S receptor，NPSR）是最新发现的一种睡眠调节系统［7］。NPS经NPSR激活下丘脑后部组胺能、食欲素能神经元产生觉醒［8］。研究发现NPS-NPSR 系统与5-HT 系统不仅参与睡眠觉醒周期的调节，还参与惊恐、焦虑及抑郁的病理生理过程［9-14］。

通过选择5-HTT 基 因5 个SNP 位点rs140700、rs2020936、rs3794808、rs6352、rs25531，NPSR 基因13 个SNP 位 点rs323922、rs324377、rs324396、rs740347、rs324957、rs324981、rs324987、rs323920、rs323917、rs2530547、rs887020、rs1963499、rs2168890进行基因分型，探讨基因多态性与PI 的关系及5-HTT、NPSR 基因多态性检测作为PI 临床重要的指标，为PI诊断和治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 原发性失眠组患者：选取2016-01—2019-12在甘肃省睡眠医学中心就诊的失眠病人和我中心承担甘肃人群睡眠状况普查（2015—2017）所检测到的PI患者为研究对象，详细告知研究内容和目的，根据《美国精神障碍诊断与统计手册》第5版标准，进行精神疾病筛查问诊及临床检查，行整夜多导睡眠监测（polysomnography，PSG）筛查。共468例患者在甘肃省人民医院接受了多导睡眠监测。排除：（1）由于其他睡眠/精神障碍以及酒精或药物等医学问题引起的继发性失眠，尤其要鉴别排除焦虑障碍所致失眠（鉴别方法根据《中国失眠防治指南》）；（2）有严重躯体疾病患者，如高血压、心脏病、甲状腺功能异常、糖尿病等；（3）有其他明确的失眠原因，如近期有重大心理应激而致失眠者；（4）不适合量表评估的低龄和高龄人群；（5）PSG 监测结果为主观性失眠患者；（6）PSG 监测结果呼吸暂停低通气指数（apnea hypopnea index，AHI）＞15者；（7）有与国外种族联姻家族史者；（8）未签署知情同意书者。最终样本包括157例原发性失眠患者，失眠组年龄18～65（44.32±10.42）岁，包括男109例（69.43%)和女48例（31.57%)。

1.1.2 健康对照组患者：133名年龄和性别匹配的正常对照者是在本医院体检中心招募的，无任何精神疾病或重大身体疾病的病史，且2 组间无血缘关系。对照组年龄18～65（43.38±9.96）岁。对照组中有90名健康男性（67.67%)和43 名健康女性（33.33%）。原发性失眠患者组与健康对照组之间，年龄、性别比例无显著差异（P=0.438）。

1.1.3 伦理声明：本研究采集所有样本及收集的临床资料均获得本人知情同意签署知情同意书，并获甘肃省人民医院伦理委员会批准。

1.2 主要试验材料

1.2.1 NPSR 基因多态位点选择：从HapMap 计划以及美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）单核甘酸多态性数据库选择5-HTT 基因及NPSR 基因功能性SNP，纳入标准为：①外显子区能改变氨基酸表达，在中国人群中最小等位基因频率（minor allele frequency，MAF）＞5%；②在非翻译区，中国人群中MAF＞5%；③在5'启动子2 kb 以内，中国人群中MAF＞5%。5-HTT 基因多态性最终入选的位点有rs140700、rs2020936、rs3794808、rs6352。NPSR 基因多态性 最 终入 选 的SNP 位点 有rs323922、rs324377、rs324396、rs740347、rs324957、rs324981、rs324987、rs323920、rs323917、rs2530547、rs887020、rs1963499、rs2168890。

1.2.2 患者心理评价：对于原发性失眠患者，采用13项抑郁自评量表（Back depression inventory，BDI）测量抑郁症状，在研究前1个月内用匹兹堡睡眠质量指数（Pittsburgh sleep quality index，PSQI）评估睡眠质量。状态-特质焦虑问卷（state-trait anxiety inventory, STAI）排除焦虑相关失眠及抑郁相关失眠，并且评估PI患者因失眠导致的焦虑及抑郁状态。

1.2.3 PSG 数据的采集：采用红外线视频/音频同步记录的整夜睡眠监测（AV-PSG）对所有病例进行整夜睡眠监测，监测室温度20～22 ℃；受试者按平时作息时间进入监测室，当晚不服用睡眠药物。整夜测试PSG记录的时间不少于7 h，所用睡眠监测仪均为美国伟康飞利浦所提供的Alice 5 多导睡眠监测仪，多导睡眠图指标包括W期、N1期、N2期、N3期、R期分别占总睡眠时间的比例。

1.2.4 DNA 提取和基因分型：对所有入组研究对象采集2 mL 肘静脉血，EDTA 抗凝（全血∶EDTA=5∶1），置2 mL离心管内，采集后迅速轻轻颠倒混匀后置于零下20 ℃冰箱保存。采用AXyprep全血基因组DNA试剂盒（Bio TeKe Corpration），按厂家推荐的方法从静脉血中提取基因组DNA。委托北京博淼生物科技有限公司，进行SNP分型检测，获得分型数据，5-HTT的SNP位点rs25531评估后无法进行同时检测，故未进行检测，不纳入基因分型数据统计。

1.3 统计分析方法连续变量为±s，分类变量为百分比，对连续变量和分类变量分别进行双尾t检验和χ2检验，采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析。在在线SHEsis 程序中计算了基因多态性各位点Hardy Weinberg（HWE）平衡检测以及等位基因和基因型分布的差异，统计分析包括HWE 平衡分析，单位点关联分析，连锁不平衡分析及位点单体型分析。在HWE 分析、单位点关联分析和两位点单体型分析中，P＜0.05 表示差异有统计学意义。连锁不平衡分析中，认为D＇＞0.7，r2＞1/3即存在较强的连锁不平衡。

2 结果

2.1 样本数据特征本次研究样本总人数共292例，剔除样本纯度及基因测序不合格者2 例，剩余290例，其中失眠组157例，占总人数54.14%；对照组133 例，占总人数45.86%，2 组研究样本中年龄、性别、体重指数（BMI）、STAI 均符合正态分布，采用组间独立样本t 检验，检验结果见表1，年龄（t=0.777，P=0.438）、性别（t=0.103，P=0.748）、BMI（t=-1.537，P=0.126）、STAI（t=29.857/28.576，P＜0.001）差异无统计学意义，而失眠严重程度指数评分（insomnia severity index，ISI）、PSQI、BDI均不符合正态分布，采用非参数检验中的两独立样本秩和检验，2组差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 研究样本的临床资料Table 1 Clinical data of the study sample

2.2 SNP 位点Hardy-Weinberg（HWE）平衡检测HWE 平衡检测示，5-HTT 基因多态性位点在2 组间均无统计学差异（P ＞0.05），即2 组都符合HWE 法则，见表2。NPSR基因多态性位点，所有对照组均无差异，即符合HWE 法则，病例组SNP 位点rs324957、rs324981和rs324987不符合HWE法则，见表3。

表2 5-HTT-SNP位点HWE平衡检测Table 2 HWE balance detection at 5-HTT-SNP sites

表3 NPSR-SNP位点HWE平衡检测Table 3 HWE balance detection at NPSR-SNP sites

2.3 单位点关联分析结果通过对5-HTT基因多态性位点在PI组与对照组的基因型和等位基因频率进行统计学分析，发现5-HTT基因上的4个SNP位点的基因型和等位基因频数在2 组之间无统计学差异（P＞0.05），见表4。对NPSR基因多态性位点在PI组与对照组的基因型和等位基因频率进行统计学分析发现SNP 位点rs323920 的T/C 型与健康对照组比较差异有统计学意义（P=0.042），SNP位点rs324957的A/G 型与健康对照组比较差异有统计学意义（P=0.023）。见表5。

表4 5-HTT多态性位点在PI组与对照之间的基因型和等位基因频率 ［n（%）］Table 4 Genotype and allele frequencies of 5-HTT polymorphisms at 5-HTT polymorphisms between PI groups and controls ［n（%）］

表5 NPSR多态性位点在PI组与对照之间的基因型和等位基因频率 ［n（%）］Table 5 Genotype and allele frequencies of NPSR polymorphisms between the PI group and controls ［n（%）］

（续表）

2.4 连锁不平衡分析结果5-HTT基因上的单核苷酸 多 态 性 位 点（rs140700、rs2020936、rs394808、rs6352）之间存在连锁不平衡，其中rs140700 与rs6352之间存在完全连锁不平衡（图1、2）。NPSR基因上的13 个位点（rs323922、rs324377、rs324396、rs324857、rs740347、rs324981、rs324987、rs323920、rs323917、rs2530547、rs887020、rs1963499、rs2168890）之间存在连锁不平衡，其中rs324377与rs323917（D＇=1.000）、rs740347 与rs1963499（D＇=1.000）、rs740347与rs2168890（D'=1.000）、rs323920 与rs323917（D＇=1.000）、rs323917 与rs2168890（D＇=1.000）、rs2530547与rs1963499（D＇=1.000）、rs2530547与rs2168890（D＇=1.000）、rs1963499 与rs2168890（D＇=1.000）之间存在完全连锁不平衡（图3、4）。

图1 5-HTT基因位点连锁不平衡D'Figure 1 5-HTT locus linkage imbalance D'

图3 NPSR基因位点连锁不平衡D'Figure 3 NPSR locus linkage imbalance D'

2.5 SNP 位点单体型分析结果对5-HTT 基因4 个SNP位点进行分析共构建出10种单倍型，其中CGTT单倍型在PI组和对照组中的差异有统计学意义（P＜0.05），见表6。对NPSR基因上13个位点构建出7常见单倍型（频数＞3%），其中CACGGTCCCCAGC单倍型在PI 组和对照组中的差异有统计学意义（P＜0.01），见表7。

表6 5-HTT基因位点单倍型分析Table 6 Haplotype analysis of 5-HTT loci

表7 NPSR基因位点单倍型分析Table 7 NPSR locus haplotype analysis

3 讨论

本次研究通过检测和分析选自5-HTT 基因上4个SNP 位点（rs140700、rs2020936、rs394808、rs6352）和NPSR 基因13 个SNP 位点（rs3243922、rs324377、rs324396、rs740347、rs32957、rs324981、rs324987、rs323920、rs323917、rs2530547、rs887020、rs1963499和rs2168890）探讨其基因多态性是否与失眠相关联。实验证明：（1）rs323920 位点和rs32957 位点基因型多态性与失眠相关联；（2）5-HTT 基因上的单核苷 酸多 态 性位 点（rs140700、rs2020936、rs394808、rs6352）之间存在连锁不平衡，其中rs140700 与rs6352之间存在完全连锁不平衡；NPSR基因上的13个位点rs324377 与rs323917（D＇=1.000）、rs740347 与rs1963499（D＇=1.000）、rs740347 与rs2168890（D＇=1.000）、rs323920 与rs323917（D＇=1.000）、rs323917 与rs2168890（D＇=1.000）、rs2530547 与rs1963499（D＇=1.000）、rs2530547 与 rs2168890（D＇=1.000）、rs1963499 与rs2168890（D＇=1.000）之间存在完全连锁不平衡；（3）所构建的单体型中，其中5-HTT基因4个位点构建的CGTT 单倍型在PI 组和对照组中的差异有统计学意义（P＜0.05），NPSR 13 个基因位点构建的CACGGTCCCCAGC 这单倍型在PI 组和对照组中的差异有统计意义（P＜0.001）。

图2 5-HTT基因位点连锁不平衡r2Figure 2 5-HTT locus linkage imbalance r2

图4 5-HTT基因位点连锁不平衡r2Figure 4 5-HTT locus linkage imbalance r2

目前对于原发性失眠的机制研究有许多，但由于其机制复杂，尚无明显定论。研究证明原发性失眠患者具有遗传倾向，其一级亲属自身发生失眠的风险增加了6.65 倍［15］。目前已有研究证实了5-HTTLPR 基因。S-allele 基因和原发性失眠之间存在关联［16］。原发性失眠症和其他失眠症的诊断表明与情绪障碍有关，失眠通常在抑郁症发作前出现，因此失眠是抑郁症的风险因素，失眠和情感这些疾病可能具有共同的背景［17-21］。研究认为原发性失眠中有部分是抑郁症，亚临床状态或抑郁潜伏期［22-28］。GUERRINI 等［20］研究表明，NPS-NPSR 系统也参与调节人类的生理性睡眠。NPSR rs324981 单核苷酸多态性与人类睡眠习惯改变相关［21-22，29-35］。研究表明NPS可能具有促进觉醒的作用，对人体睡眠与觉醒产生一定调节作用，可能与失眠等多种疾病发生具有密切相关性［23，36-40］，研究发现大鼠NPS免疫反应神经元主要分布于脑干蓝斑核、三叉神经感觉主核、脑桥网状核尾侧部及橄榄周核等，NPS经NPSR激活下丘脑后部组胺能、食欲素能神经元产生觉醒［8，41-43］。而查阅文献未发现5-HTT 或NPSR SNP 位点连锁不平衡和单倍型分析与失眠的相关研究，本试验以原发性失眠患者为研究对象，选取5-HTT基因上的4个SNP位点和NPSR上的13个SNP位点进行基因分型，探讨其与原发性失眠之间的相关性。首先，通过单个SNP关联分析，分析了5-HTT基因多态性上的4个SNP 位点及NPSR 上的13 个SNP 位点；其次，通过连锁不平衡检验分析及单倍体分析进一步证实5-HTT基因多态性和NPSR 基因多态性与原发性失眠的关联。本研究进行的是SNP位点与原发性失眠之间的关联研究，今后力求在发现SNP相关性的同时，通过一些体外的动物实验进行验证，并揭示其分子生物学机制，为原发性失眠的诊断、治疗、预防等提供更加深入理论依据。

本研究样本量大，结果可信度较高，将来对研究中两个基因上的17个多态性位点的重复测定分析应关注研究结果的一致性和可靠性。本研究主要局限是中国汉族人群分布广泛，试验样本采取自一个地区或许不能够有效代表广泛的中国原发性失眠群体，因此将来的研究中应在多个地区收集原发性失眠患者样本。