木拉提艾则·玉素甫，阿合力·那斯肉拉，沈芳，王玉星，新华·那比

（1.新疆医科大学 药学院，乌鲁木齐 830002；2.新疆医科大学附属肿瘤医院综合特需科，乌鲁木齐 830011）

0 引言

结肠癌（Colorectal Cancer,CRC）是临床最常见的胃肠道恶性肿瘤，具有早期隐蔽性较高、病情发展迅速、高死亡率等特点，目前全球死亡率居所有恶性肿瘤的第3位，5年生存率约40%～60%[1]。以氟尿嘧啶为主的药物化疗是晚期结肠癌患者最主要的治疗方法，但化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时对其他正常细胞亦有损害，从而影响患者的生活质量和治疗效果[2]。因此寻找一个低毒高效并且能够增强机体免疫功能的抗肿瘤药物成为了目前研究的热点。

肿瘤的发生与发展与机体自身免疫系统密切相关，T淋巴细胞是机体调节免疫反应中最主要的效应细胞[3]。根据分型不同可分为表达CD4+的辅助性T细胞（Helper T cells，Th）及表达CD 8+的细胞毒性T细胞（Cytotoxic T cell，CTL）[4]。Th细胞则又可分为Th1和Th2，其中Th1主要分泌IL-2、IFN-γ等细胞因子辅助CTL分化和增殖，从而介导抗肿瘤的细胞免疫应答，而Th2则主要分泌IL-10等细胞因子介导体液免疫，从而抑制Th1的增殖[5]。T淋巴细胞亚群的检测对恶性肿瘤的诊断、治疗及预后均有重要意义，研究表明肿瘤发生时会影响机体的免疫功能，导致T淋巴细胞CD4+/CD8+T细胞的比值降低，Th1/Th2比例失衡[6]。此外，CD4+T细胞的亚群调节性T细胞（Treg）也在维持免疫系统稳定中也起到关键作用，Treg细胞在肿瘤微环境中大量增加，抑制了免疫系统对癌细胞的免疫应答，导致肿瘤细胞免疫逃逸，抑制抗肿瘤免疫的功能[7]。肿瘤组织内浸润高密度的Treg细胞常提示了较差的临床预后，Treg细胞中Foxp3是最具有特异性和调节性的标记物，该标记物会影响Treg活化及其功能稳定的各种分子导致肿瘤免疫抑制及免疫逃逸[8-9]。

益生菌一直是国内外研究的热点,对于益生菌在调节肠道菌群、预防糖尿病、提高机体免疫力等方面作用已被熟知[10-13]。目前对益生菌研究重点转为它们对免疫系统的调控作用和抗肿瘤方面的作用机制。在一项临床实验中将益生菌丁酸梭菌MI-YAIRI 588作为干预措施用于癌症患者临床治疗，结果表明MI-YAIRI 588治疗能够延长肿瘤患者的总生存期[14]。再另一项研究中；研究者通过从健康人肠道中刷选出11株具有抗肿瘤免疫潜能的有益菌群，发现11株菌的复合定植具有增强肿瘤模型小鼠的ICB免疫疗法的作用[15]。本课题组前期研究表明，驼乳源性4种复合益生菌能够部分缓解环磷酰胺对小鼠免疫抑制作用,调节Th1/Th2平衡,起到免疫调节和保护作用[13]。本研究旨在评价驼乳源性复合益生菌对CT-26荷瘤小鼠抗肿瘤免疫功能的影响，为临床治疗提供更多药理学基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

3种乳酸菌及一种酵母菌均通过传统发酵的方法，将来源于乳源性发酵的驼乳及乳酪乳清中提取的4种复合益生菌，分别为；东方伊萨酵母菌(Issatchenkia orientalis)、高加索酸奶乳杆菌(Lactobacillus kefir)、马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens),戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus),并由中国农业科学院微生物研究所鉴定[16-17]。

1.1.2 动物

SPF级健康雌性BALB/C小鼠50只，平均体质量（16±2）g，周龄6周，由新疆医科大学动物实验中心提供。生产许可证号；SCXK（新）2018-0002。饲养环境为光照12 h/d,室温(21±2)℃,湿度为50%±5%,普通饲料喂养。

1.1.3 瘤株

CT26.WT小鼠结肠癌细胞（货号：ZQ 0190），由上海中乔新舟生物科技有限公司所提供。

1.1.4 试剂

MRS肉汤培养基、麦芽汁液体培养基、MRS琼脂培养基、沙氏琼脂培养基均，青岛日水生物技术有限公司；氟尿嘧啶注射液（批准文号：国药准字H 31020593），上海旭东海普药业有限公司；FBS(胎牛血清，批号：10099-141），Gibco；Penicillin-Streptomycin双抗(批号：51H 351），ExCell Bio公司；DMSO(二甲基亚砜，批号：1213C0314;北京索莱宝科技有限公司);RPMI1640培养基（Hyclon）红细胞裂解液（批号：BL503B），biosharp公司；CD 4、CD 8抗体，eBioscience公司；苏木精-伊红（HE）染色试剂盒（货号：C0105S），上海碧云天；IL-2 ELISA试剂盒（批号：XY-091202M）、IL-10 ELISA试 剂 盒（批 号：XY-091210M）、IFN-ELISA试剂盒（批号：XY-090617M），上海优选生物科技有限公司。

1.1.5 仪器与设备

CO2培养箱，Thermo Corporation；流式细胞仪，American BD；酶联检测仪，American Bio-RAD；AY120电子分析天平，日本岛津；TDL-5A离心机，上海菲恰尔分析仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物造模

将CT 26.WT结肠癌细胞置于完全培养基中培养并传代,将处于对数生长期的细胞制成浓度为1×107/mL的细胞混悬液，取40只BALB/C小鼠,于小鼠右腋下部位皮下接种200μL。小鼠成瘤接种后，每天检查肿瘤生长情况,全程均采取无菌操作,待肿瘤生长至约2～5 mm后，触摸有不规则的硬块，既模型建立成功。

1.2.2 动物分组、给药

将种瘤小鼠小鼠随机分为4组，既；模型组、阳性对照组（5-Fu）、复合益生菌高剂量组、复合益生菌低剂量组，另取未种瘤的正常BALB/C小鼠做正常对照，每组10只。5-Fu组以25 mg/kg（用生理盐水配置，现配现用）腹腔注射给药，每2 d一次，复合益生菌组高低剂量组分别灌胃给与（乳杆菌1.0×1010CFU/d+酵母菌1.0×108CFU/d及乳杆菌1.0×108CFU/d+酵母菌1.0×106CFU/d，0.3 mL），空白组与模型组每天以0.9%生理盐水灌胃，连续21 d，开始给药后每3 d使用游标卡尺测量各组荷瘤小鼠的肿瘤长径和短径。

1.2.3 检测体质量、瘤重、抑瘤率和脾脏指数

末次给药24 h后分别无菌条件剥取肿瘤组织、胸腺组织及脾脏组织,精密称定质量后,分别计算抑瘤率及脏器指数。

1.2.4 肿瘤组织病理学

分别取各组小鼠完整肿瘤组织，于4%中性甲醛固定，并用常规石蜡包埋，再将石蜡包埋块切片、脱蜡，进行HE染色，后用扫描仪对切片进行图像扫描。

1.2.5 流式细胞术检测T淋巴细胞亚群

各组脾脏经无菌针头穿刺、PBS冲洗、用200目筛网研磨过滤调整细胞浓度为1×106/mL的单细胞混悬液。后加入500μL红细胞裂解液，1 000 r/min离心3 min，弃上清。PBS重悬细胞，加入FITC-CD4和APC-CD8a抗体，各5μL。4℃避光孵育15 min，PBS洗涤两次后重悬细胞，流式细胞仪上机检测。并计算CD4+/CD8+T细胞比值比值。

1.2.6 免疫荧光检测Foxp3+Tregs密度

各组肿瘤组织石蜡切片常规脱蜡，用0.01 mol/L PBS(p H 7.4)洗涤10 min×3次,加封闭液,加入Foxp3一抗（1∶300稀释）、4℃过夜。加入二抗（抗兔，1∶100稀释）后，激光共聚焦下观察Foxp3染色情况。

1.2.7 Elisa法检测血清IL-2、IL-10、IFN-γ含量

EP管收集各组荷瘤小鼠血液标本，4℃、3 000 r/min离心20 min，收集血清，根据试剂盒说明书步骤操作，计算出血清IL-2、IL-10、IFN-γ含量。

1.2.8 统计学处理

2 结果与分析

2.1 复合益生菌对CT-26荷瘤小鼠的影响

各组荷瘤小鼠肿瘤生长曲线如图1(a)所示，与模型组比较，复合益生菌高、低剂量组以及5-氟尿嘧啶组小鼠肿瘤生长速度相对缓慢；从给药第10日起，复合益生菌高剂量组和5-氟尿嘧啶组小鼠肿瘤体积均显著小于模型组（P＜0.05）；复合益生菌低剂量组肿瘤虽有生长缓慢趋势，但是无统计学意义。各组小鼠肿瘤给药21 d后，肿瘤实物图如图1(b)所示，经过称重及计算结果如表1所示，复合益生菌高组以及5-氟尿嘧啶组荷瘤小鼠肿瘤重量均显著小于模型组（P＜0.05），与模型组比较复合益生菌低剂量组肿瘤质量无统计学意义，5-氟尿嘧啶组、复合益生菌高剂量组、复合益生菌低剂量组抑瘤率分别为81.65%、41.49%、17.00%。说明乳源性复合益生菌具有一定程度减缓肿瘤生长的作用。

表1 各组CT-26荷瘤小鼠瘤重及抑瘤率比较(n=10,±s)

表1 各组CT-26荷瘤小鼠瘤重及抑瘤率比较(n=10,±s)

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别 剂量 瘤体质量/g 肿瘤抑制率/%模型组 - 4.94±0.67 -复合益生菌高剂量组乳酸菌1.0×1010酵母菌1.0×108 2.89±1.01** 41.49复合益生菌低剂量组乳杆菌1.0×108酵母菌1.0×106 4.10±0.54 17.00 5-氟尿嘧啶组 25 mg·kg-1 0.91±0.41** 81.65

图1 复合益生菌和5-氟尿嘧啶处理对CT-26荷瘤小鼠重量生长曲线和瘤质量的影响(n=10,±s)

2.2 复合益生菌对荷瘤小鼠免疫器官指数的影响

由表2可见，与空白组比较；模型组荷瘤小鼠脾脏指数显著降低（P＜0.01），与模型组比较，复合益生菌低剂量组、5-Fu组脾脏指数虽有升高趋势但无显著性差异（P＞0.05）。复合益生菌高剂量组脾脏指数显著性升高差异有统计学意义（P＜0.05）；与空白组比较模型组胸腺指数显著性降低（P＜0.01），与模型组比较复合益生菌高、低剂量组均能提高荷瘤小鼠胸腺系数，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），而5-氟尿嘧啶组差异无统计学意义（P＞0.05）。说明乳源性复合益生菌在减缓肿瘤生长的同时，对荷瘤小鼠免疫器官具有一定的保护作用，提示乳源性复合益生菌的抗肿瘤作用与免疫有关。

表2 各组CT-26荷瘤小鼠脾脏和胸腺指数比较(n=10,±s)

表2 各组CT-26荷瘤小鼠脾脏和胸腺指数比较(n=10,±s)

注：P#＜0.05，P##＜0.01VS正常组；P*＜0.05，P**＜0.01VS模型组。

组别 剂量 脏器指数脾脏指数 胸腺指数空白组 - 7.08±0.51 1.51±0.44模型组 - 4.89±0.22## 0.84±0.12##复合益生菌高剂量组 乳酸菌1.0×1010酵母菌1.0×108 6.97±0.69* 1.16±0.15**复合益生菌低剂量组 乳杆菌1.0×108酵母菌1.0×106 5.04±0.57 1.38±0.34*5-氟尿嘧啶组 25 mg·kg-1 5.12±0.76 0.70±0.35

2.3 复合益生菌对荷瘤小鼠肿瘤组织病理学影响

模型组肿瘤细胞呈椭圆形，细胞核大，细胞形态完好，肿瘤细胞数目较多，坏死区域较少；与模型组比较，复合益生菌高、低剂量组肿瘤细胞数目减少，肿瘤细胞密度降低以及存在部分坏死区域，但不及5-氟尿嘧啶组。此外符合益生菌高、低均出现不同程度免疫细胞浸润的现象，如图2所示。

图2 复合益生菌对荷瘤小鼠肿瘤组织病理学变化的影响(HE染色，×100)

2.4 复合益生菌对荷瘤小鼠脾脏中CD4+/CD8+T细胞的影响

由表3可见，与正常组比较，模型组小鼠脾脏CD4+T细胞含量显著降低（P＜0.01），CD8+T细胞比例显著升高（P＜0.01）,CD4+/CD8+T细胞比例降低（P＜0.01）;与模型组比较，复合益生菌低剂量组CD4+T细胞升高，但无统计学差异（P＞0.05），CD8+T细胞含量显著降低（P＜0.05），CD4/CD8+T细胞比例具有升高趋势，但无统计学差异（P＞0.05）；与模型组比较，复合益生菌高剂量组CD4+T细胞升高（P＜0.01），CD8+T细胞含量显著降低（P＜0.05），CD4+/CD8+T细胞比例显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，5-Fu组CD 4+T细胞比例显著降低（P＜0.05），CD8+T细胞比例升高（P＞0.05），CD4+/CD8+T细胞比例降低（P＜0.05）。说明乳源性复合益生菌可以调节荷瘤小鼠CD4+/CD8+T的比值，可能是通过对T淋巴细胞的调控作用，从而提高荷瘤小鼠的抗肿瘤免疫。

表3 复合益生菌对荷瘤小鼠脾脏T淋巴细胞亚群的影响(n=10,±s)

表3 复合益生菌对荷瘤小鼠脾脏T淋巴细胞亚群的影响(n=10,±s)

注：P#＜0.05，P##＜0.01VS正常组；P*＜0.05，P**＜0.01VS模型组。

组别 CD4+T CD8+T CD4+/CD8+T正常对照组 49.98±5.58 15.18±2.61 3.38±0.79模型组 27.36±5.14## 29.85±6.92## 0.97±0.34##低剂量组 31.83±3.28 23.23±3.07* 1.40±0.30高剂量组 37.88±6.84** 20.9±4.81** 1.87±0.44**阳性药组 15.85±6.80* 31.45±3.46 0.50±0.23*

2.5 复合益生菌对各组小鼠瘤组织Foxp3+Treg浸润的影响

由图3可见，Foxp3染色密度；与模型组比较，复合益生菌高剂量组、阳性药组Foxp3密度明显降低，而复合益生菌低剂量组无明显差异。

图3 各组小鼠肿瘤组织Foxp3+Treg免疫荧光染色观察

2.6 复合益生菌对荷瘤小鼠血清免疫因子水平的影响

如图4所示，与正常组比较，模型组小鼠血清中免疫因子IL-2、IFN-γ水平显著下调（P＜0.05），IL-10水平明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，复合益生菌高剂量组小鼠血清中IL-2水平显著升高（P＜0.01），IFN-γ水平显著升高(P＜0.01)，IL-10水平显著性下降（P＜0.05）。与模型组比较；复合益生菌低剂量组IL-2、IFN-γ水平显著升高（P＜0.05，P＜0.01），IL-10水平虽有下降，但无统计学差异（P＞0.05)。

图4 小鼠血清中IL-2、IFN-γ、IL-10等细胞因子的分泌水平

3 讨论

随着我国结直肠癌的发病率与死亡率逐年升高，结直肠的治疗与预防已成为一项人类面临着的巨大挑战。肿瘤治疗传统方法是依靠外界力量杀死肿瘤细胞，作用靶点是肿瘤细胞，而目前新型肿瘤免疫治疗是利用免疫系统、恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制与清除肿瘤的一种治疗方法[18]。Li等研究表明，名为Prohep的益生菌混合物可使HCC荷瘤小鼠肿瘤体积减小40%，其机制可能是通过降低肿瘤微环境中的炎症因子，通过改善小鼠肠道中的抗炎性环境来实现的[19]。Hatmal等通过体外试验验证了开菲尔乳对人体慢性粒细胞白血病细胞K562和结肠癌细胞HCT 11均有一定的抑制作用[20]。而不同菌株益生菌益生特性具有一定的差异，在本研究中乳源性复合益生菌高、低剂量组均可使CT-26荷瘤小鼠肿瘤质量不同程度的降低，其中复合益生菌低剂量组抑瘤率为17%，复合益生菌高剂量组抑瘤率为41.49%。此外复合益生菌高、低剂量组小鼠胸腺指数和脾脏指数均有不同程度的增加，提示乳源性复合益生菌减缓CT-26荷瘤小鼠肿瘤体积的同时，对荷瘤小鼠的脏器指数具有一定的保护作用。脾脏和胸腺为机体重要的免疫器官，是发生免疫应答及合成免疫活性物质的重要场所，脾脏和胸腺指数在一定程度上反映了机体免疫功能的强弱。这提示驼乳源性复合益生菌发挥抗肿瘤作用的机制可能是通过提高机体免疫功能途径。

有研究表明肿瘤患者的CD4+T细胞亚群比例下降，CD8+T细胞亚群相对升高，CD 4+/CD8+T细胞比值的降低，这表明肿瘤的发生与发展与机体免疫密切相关[21]。同时在正常情况下，机体Th1/Th2处于动态平衡，许多研究均证实肿瘤发生时免疫反应向Th2漂移，在进展期肿瘤病人外周血中IFN-γ分泌减少，IL-10分泌增加导致在肿瘤生长时，Th1/Th2向Th2漂移[22]。刘文立等研究发现白及多糖可以提高CT-26荷瘤小鼠外周血中CD4+T、CD 4+/CD8+T淋巴细胞的比值，降低CD8+T细胞的数量，从而降低CT-26荷瘤小鼠的肿瘤质量[23]。在本研究中驼乳源性复合益生菌高、低剂量组均可提高荷瘤小鼠脾脏中CD4+T细胞比例，消耗CD8+T细胞降低其所占比例，通过抑制CD8+T细胞调整CD 4+/CD8+T细胞平衡，并使荷瘤小鼠血清中Th1型细胞因子IL-2和IFN-γ含量升高(P＜0.01)，Th2型细胞因子IL-10含量降低(P＜0.05)，提示乳源性复合益生菌可以通过提高细胞免疫中T淋巴细胞亚群数量的变化，提高CD4+T、CD4+/CD8+T细胞的平衡，减少Tregs在肿瘤组织的浸润，并逆转Th1/Th2漂移，恢复Th1/Th2型细胞因子平衡，与既往研究结果一致。提示驼乳源性复合益生菌可能是通过细胞免疫途径发挥抗肿瘤作用。

4 结论

综上所述,4种驼乳源性具有免疫调节活性的复合益生菌具有减缓CT-26结肠癌荷瘤小鼠肿瘤生长的作用，具体的作用机制是通过提高荷瘤小鼠免疫为出发点，调整CD 4+/CD8+T淋巴细胞的平衡，改善Th1/Th2的亚群比例，从而提高荷瘤小鼠的抗肿瘤免疫抵御肿瘤,有望于临床上应用于肿瘤患者的辅助治疗。