刘文静，杨 娟，张楚天，孙 攀，黄美雅,3，黄云梅,3

(福建中医药大学 1.药学院、2.中西医结合研究院;3.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建 福州 350122)

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是一种全身性骨代谢疾病，女性绝经后体内雌激素水平下降，导致骨量减少、骨的微细结构破坏，骨脆性增加，并易发骨折。中医药防治骨质疏松症具有独特作用，如淫羊藿、补骨脂、杜仲、巴戟天等以其不良反应小的临床特点逐渐得到广大患者的肯定[1]。巴戟天主产于我国广东、福建、广西等地，中药取茜草科植物巴戟天(morindaofficinalisHow)的干燥根，可补肾阳，强筋骨，祛风湿[2]，具有抗炎、抗衰老、抗疲劳、促进骨生长、调节免疫等作用。巴戟天可能通过降低NFATc1的表达水平来抑制破骨细胞生成[3]，通过调节凋亡相关基因Bcl-2和Bax表达来抑制成骨细胞凋亡[4]等，从而改善骨质疏松症。

近年来，代谢组学已广泛应用于中药成分及中药作用机制的研究，通过检测机体基础代谢的变化，为阐明代谢性疾病的发病过程和病理原因提供依据[5]。基于液相色谱与质谱联用(LC-MS)的代谢组学分析，简便可行，使代谢物覆盖率大大提高。本文基于LC-MS/MS技术的代谢组学方法检测巴戟天干预去卵巢后骨质疏松大鼠血清内源性代谢产物的变化，分析其可能受影响的代谢途径，探讨巴戟天治疗绝经后骨质疏松可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 药材中药巴戟天购于福建省医药公司。将3 kg生药粗粉碎后，用20倍量蒸馏水浸没药材，100 ℃煎煮1 h，过滤，将药渣用等量蒸馏水重复提取一次，取两次的药液混合，过滤除渣，低温减压浓缩成相当于生药量1 kg·L-1的浸膏，4 ℃保存备用。

1.2 仪器与试剂Discovery Wi双能X线骨密度仪(美国Hologic公司)；IG-A1000N万能材料试验机(日本岛津仪器公司)；小型台式冷冻型离心机(德国艾本德股份公司)；Q Exactive质谱仪(美国Thermo Scientific公司)；UltiMateTM3000高效液相色谱系统(美国Thermo Scientific公司)；HYPERSIL GOLD AQ色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm，美国Thermo Scientific公司)；Allegra 64R冷冻离心机(美国Beckman公司)；涡旋混合器(美国SI Votex-Genie2公司)。

1.4 方法

1.4.1动物实验及样本采集 42只雌性SD大鼠随机分成假手术组、模型组、巴戟天组，每组14只。模型组和巴戟天组大鼠以10%水合氯醛麻醉(0.3 mL/100 g)，摘除双侧卵巢，假手术组只切除卵巢周围少许脂肪组织，术后在大腿部以8万单位/只注射兽用青霉素抗感染。1周后巴戟天组大鼠按生药5 g·kg-1·d-1体质量灌胃给予巴戟天水提取物，模型组与假手术组分别给予生理盐水灌胃2 mL/只。分别于第6周和第12周各取材一半，取大鼠右侧股骨、胫骨及第4腰椎，并随机每组采4只大鼠腹主动脉血。收集的血液样品凝固后离心(3 500 r·min-1,15 min,4 ℃)得到血清。动物实验获得福建中医药大学实验动物伦理委员会批准，符合中国伦理委员会有关动物研究指导原则。

1.4.2骨密度检测 骨密度检测于福建省中医科学研究院，在骨密度扫描仪探头下进行检测，并由计算机自动分析得出大鼠右侧股骨骨密度(bone mineral density,BMD)相关数据。

1.4.3骨骼生物力学性能检测 骨骼生物力学性能检测于福建中医药大学骨伤科学实验室，使用万能材料试验机分别运用三点抗弯法和压缩法测定大鼠右侧胫骨以及第4椎的最大载荷。

1.4.4血清样本检测 大鼠血清代谢组学检测由北京博奥晶典生物技术有限公司完成。具体实验方法和条件如下：

1.4.4.1 样品处理 将样品冰上解冻，取350 μl样品，离心(1 400g,10 min,4 ℃)去除血细胞。取300 μL样品，加入900 μL预冷甲醇溶液。震荡混匀2～3 min，使其萃取充分，离心(14 000g,10 min,4 ℃)。取240 μL上清液，共4份，真空干燥后，每份加60 μL 50%(V/V)甲醇-水配制样品复溶液复溶，离心(14 000g,5 min,4 ℃)，取40 μL上清转入新的上样瓶，加等体积50%(v/v)甲醇-水混合，离心(14 000g,5 min,4 ℃)，取上清液用于超高效液相色谱-质谱(UHPLC-MS/MS)检测。

1.4.4.2 色谱条件 正离子模式：流动相为0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)；负离子模式：流动相为5 mmol·L-1醋酸铵水溶液(A)-乙腈(B)。梯度洗脱：0～1 min，100% A，0%B；9～12 min，0% A，0% B；12.1～15 min，100% A，0% B；流速0.35 mL·min-1。

综上所述，在部编版小学低年级语文教材中，识字写字板块强调要让学生坚持多认少写的原则来进行识字写字的学习。为了提高学生的识字写字学习效率，教师要积极寻找灵活有效的识字写字方法，提高学生的识字写字效率。

1.4.4.3 质谱条件 1 μL质量控制(quanlity contral，QC)样品上清液，先进正离子扫描，所有样品结束后再进行负离子扫描，全扫描范围m/z 70～1 050。母离子的离子强度TOP15，使用HCD方法碎裂，进行二级质谱序列鉴定，获得质谱检测原始数据。

1.4.5数据处理 对血清样品进行LC-MS/MS检测，采用超高效液相色谱-质谱联用技术(UHPLC-MS/MS)。所得数据导入Compound Discover (CD)软件，对原始采集数据进行校正包括噪音过滤、保留时间对齐、质谱峰提取、样品间化合物对应、化合物鉴定、Gap的填补、背景值的扣除及数据归一化与标准化处理等。其中，化合物鉴定由mzCloud和综合数据库ChemSpider在线搜索完成，设定mass tolerance在5 ppm范围内即表示理论分子量与实测分子量匹配，通过系统自动检测与实测分子量匹配的代谢物的信息。基于QC样品TIC图叠加，查看UHPLC-MS检测系统的稳定性；采用OPLS-DA建模方法利用正交信号矫正的思想，把与响应变量无关的正交变量分离出去。通过层次聚类分析观察组间变化情况及火山图展示代谢物变化情况。运用SPSS 17.0进单因素方差分析，通过京都基因与基因百科全书KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomoes)Pathway数据库进行差异代谢物的代谢通路注释和富集分析。

2 结果

2.1 大鼠骨密度检测结果大鼠股骨近端BMD检测结果显示(Tab 1)：模型组BMD值都明显低于同期假手术组(6周P<0.05，12周P<0.01)，巴戟天组较同期模型组其BMD有所提升。

Tab 1 Bone mineral density of proximal

2.2 大鼠骨生物力学检测结果胫骨与腰椎生物力学检测结果显示(Tab 2)：模型组骨组织生物力学最大载荷均明显低于同期假手术组(6周胫骨最大载荷P<0.05，腰椎最大载荷P<0.005；12周均为P<0.005)；巴戟天组较模型组有一定程度提升(6周腰椎最大载荷P<0.005)。

Tab 2 Maximum load test results of tibia and fourth lumbar vertebra of rats in each group(KN,

Tab 3 Main parameters of OPLS-DA model

Fig 1 Tic diagram of rat serumA：Positive ion mode;B：Negative ion mode

2.3 基于LC-MS/MS平台的大鼠血清代谢组学检测QC样品基于UHPLC-MS/MS平台结合正离子模式和负离子模式两种电离模式，通过TIC图叠加，查看LC-MS检测系统的稳定性。大鼠血清样品总离子色谱图见Fig 1。

2.4 血清代谢物谱的组间差异使用正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)研究假手术组、模型组及巴戟天组大鼠的代谢物谱差异。假手术组和模型组的组内血清样本点在一定范围较好的聚集，且组间差异明显，说明去卵巢后骨质疏松大鼠机体生理及物质代谢已经发生了明显的改变；模型组和巴戟天组组间样本完全区分开，说明药物干预后大鼠机体代谢发生变化(Fig 2)。OPLS-DA 模型的主要参数(Tab 3)验证了本文建立的OPLS-DA模型的可靠性较高。

2.5 层次聚类分析结果分层聚类分析所得热图直观显示出正负离子通道鉴定的所有血清代谢物在各组之间的含量变化趋势,干预6周与干预12周趋势整体一致，12周时尤为明显，如Fig 3所示。图中水平轴和垂直轴分别代表样品与变量信息。模型组与假手术组显著分开提示去卵巢大鼠机体代谢发生变化；巴戟天组与模型组明显分开且接近假手术组，提示中药可调节去卵巢大鼠机体的代谢。

Fig 2 OPLS-DA score plots derived from LC-MS/MS spectra of serum

2.6 表征代谢物谱差异的生物标志物火山图(Fig 4)中每个点代表一个代谢物，使用OPLS-DA模型中变量重要性投影(VIP)参数评价潜在的生物标志物。经t检验(Pvalue <0.05，VIP>1)最终筛选出29种具有显著差异的化合物(Tab 4、5)。组间对比结果显示：模型组脂类及核酸代谢相关的化合物乙酰左旋肉碱、花生四烯酸、硬脂酸、二十碳五烯酸、尿嘧啶、胞嘧啶核苷及2’-脱氧尿苷等含量较假手术组均下降。同期巴戟天组较模型组脂类及核酸代谢相关的化合物乙酰左旋肉碱、花生四烯酸、硬脂酸、二十碳五烯酸、尿嘧啶、胞嘧啶核苷及2′-脱氧尿苷等含量均上升。经单因素方差分析显示(Fig 5)，泛酸、皮质酮、硬脂酸、尿嘧啶、胞嘧啶核苷、2′-脱氧尿苷等组间差异有显著性(P<0.05)。

2.7 差异代谢物的相关代谢通路富集分析结合2.6中所筛选的差异代谢物，通过其相关代谢通路富集分析发现，不饱和脂肪酸的生物合成、类固醇激素生物合成及初级胆汁酸代谢等通路影响值>0.10。表明OPLS-DA所筛选的差异代谢物与这些代谢途径密切相关，推测去卵巢后大鼠体内代谢变化及巴戟天发挥治疗作用与这些代谢途径有关。

Tab 4 Chemical information of related markers in postmenopausal osteoporosis model after normalization

Fig 4 Volcano picture of DEM about potentially different metabolites

Fig 5 Metabolites with significant difference (n=4)

Tab 6 Result from pathway analysis (Impact>0.10)

3 讨论

本研究采用去卵巢术建立骨质疏松大鼠模型，通过骨密度与骨生物力学检测结果可知，巴戟天干预可改善去卵巢后骨质疏松症骨量减少和骨强度下降，与既往研究结果一致[6]。

有临床研究发现，绝经后骨质疏松患者血清中油酸、亚油酸及花生四烯酸等 5 种脂肪酸水平高于正常妇女[7]。何若晗等[8]的代谢组学研究表明，去卵巢大鼠机体代谢紊乱，内源性代谢物含量变化异常，尤其是甘油三酯、鞘磷脂和 ω-6 不饱和脂肪酸等脂代谢相关产物。盛玲玲等[9]基于尿液代谢的组学研究发现去卵巢骨质疏松大鼠初级胆汁酸生物合成和嘌呤代谢紊乱。由此可见代谢异常与 PMOP 密切相关。

本研究发现去卵巢大鼠体内脂代谢相关因子的变化最明显。不饱和脂肪酸如硬脂酸、二十碳五烯酸、花生四稀酸、油酸和亚油酸,及乙酰左旋肉碱等在模型组中的含量较假手术组降低。KEGG数据库在线检索发现这些代谢物与不饱和脂肪酸生物合成及花生四烯酸代谢等代谢通路有关。另有研究发现，乙酰左旋肉碱具有抗氧化、抗炎症及促进脂肪代谢等作用[10]。本研究结果是对PMOP与脂代谢相关理论的补充。

大量实验研究表明，脂代谢紊乱可导致骨代谢异常。脂肪细胞和成骨细胞均由骨髓间充质干细胞分化而来，二者此消彼长。脂代谢紊乱使成骨细胞分化减少，从而引起骨代谢相关疾病[11]。脂代谢可通过多种通路影响骨代谢。脂代谢与骨代谢的共同信号通路中，氧化应激信号通路中氧化脂质可促进骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化，刺激破骨细胞生成导致骨吸收，恶化骨破坏，并且诱发炎症反应[12]。多不饱和脂肪酸可通过减少炎症类花生酸，发挥抗炎作用，改善骨骼肌质量[13-14]，补充ω-3多不饱和脂肪酸(主要包括二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸)可降低骨量丢失，提高骨强度[15]。本研究发现，巴戟天组较模型组含量升高，说明巴戟天可能通过调节脂代谢途径改善去卵巢骨质疏松。

此外，本次实验还发现，模型组中与核酸代谢相关的尿嘧啶、胞嘧啶核苷、2’-脱氧尿苷等化合物含量较假手术组降低，而巴戟天组含量较模型组均升高。皮质酮、泛酸及胆汁酸等差异代谢物含量也发生了变化。皮质酮作为类固醇激素之一，与花生四烯酸相互作用，干扰正常生理行为并引起氧化应激反应，降低雌激素的护骨作用[16]。泛酸与生物体内能量调节及糖类、脂肪、蛋白质的代谢相关，是合成类固醇所必需的物质。胆汁酸可调节脂代谢、糖代谢、炎症反应[17]，也可影响维生素D吸收，对成骨细胞产生不利影响[18]。

综上所述，基于LC-MS技术的代谢组学研究发现，去卵巢后大鼠体内脂代谢、嘧啶代谢及能量代谢等代谢紊乱，巴戟天干预可改善其代谢情况。因此，巴戟天可能通过调节不饱和脂肪酸的生物合成、类固醇激素生物合成、胆汁酸代谢及嘧啶代谢等多种代谢通路改善绝经后骨质疏松。本研究可为巴戟天后续研究与开发提供新的实验依据。