何 靖，余 莹，罗 曼，蓝 海，吴 伟，黄晓华，古学奎*

（1.广州中医药大学第一附属医院，广州 510405；2.深圳大学附属华南医院，广东 深圳 518111；3.广州中医药大学附属顺德医院，广东 顺德 528300）

阿霉素（DOX）作为蒽环类化疗药物的代表药，由于其抗瘤谱广，在临床作为白血病、淋巴瘤、乳腺癌、软组织肉瘤等诸多肿瘤化疗方案的重要成分，被广泛使用，其累计剂量达550 mg·m-2时[1]，约7%患者会出现心力衰竭。且随着药物剂量的增加，其对心脏的累积毒性作用也越来越大，继而出现心悸、呼吸困难、胸闷、胸痛、心肌酶学改变，甚则心衰等系列临床表现[2-3]。因此，临床用药过程中，防治DOX所致的急性心力衰竭（简称急性心衰）至关重要。

参芪扶正注射液（SFI）由补气佳药之党参和黄芪组成，是临床益气扶正、固本祛邪的常用中成药制剂，尤其在抗肿瘤的辅助治疗中，可以改善因正气亏虚或耗损而出现的神疲乏力，少气懒言、心悸气短等诸症，对于DOX所致的急性心衰出现的心气虚症状效果尤佳[4-6]。然而，尽管其在临床应用广泛，但关于参芪扶正注射液对DOX急性心衰疗效的作用机制尚不明确。磷酸肌醇3激酶/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶（phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B signaling pathway，PI3K/Akt）信号通路在心脏信号传导、心肌细胞生长增殖与凋亡、维持内环境稳态等方面发挥重要作用，且参与调控细胞的损伤与修复、存活与凋亡[7-8]。课题组前期构建网络药理学，通过KEGG通路富集分析表明，PI3K-Akt信号通路是参芪扶正注射液防治蒽环类药物引起的心脏毒性的主要作用途径为之一[9]，因此，本研究继续课题组思路，试通过构建大鼠的阿霉素急性心衰模型，从PI3K-Akt信号通路相关的生物学指标进一步探究参芪扶正注射液对其的作用机理。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

SD大鼠，雄性12只，180～220 g，厂家：湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2016-0002。

1.2 实验试剂与仪器

1.2.1 实验试剂 丽珠集团利民制药厂的参扶正注射液（批号：190419）；深圳万乐药业有限公司的盐酸阿霉素（批号：1812E1）；江苏奥赛康药业有限公司的DZR（批号：E1905052）；上海展云化工有限公司的水和氯醛（批号：171110）；Solarbio公司的伊红染色液（G1100）；碧云天生物试剂TUNEL检测试剂盒（C1090）；北京普利莱基因技术有限公司的RIPA细胞裂解液（C1053）；北京康为世纪生物科技有限公司的BCA蛋白定量试剂盒（BCAProteinAssayKit）（CW0014S）；其余试剂与仪器尚有：内参一抗：Mouse Monoclonal Anti-GAPDH（TA-08，中杉金桥，1/2000）；二抗：辣根酶标记山羊抗鼠IgG（H+L）（ZB-2305，中杉金桥，1/2000）；目的一抗：Rabbit Anti-Akt（ab8805，Abcam，1/500）；目的一抗：Rabbit Anti-P-akt（bs-2720R，Bioss，1/500）；二抗：辣根酶标记山羊抗兔IgG（H+L）（ZB-2301，中杉金桥，1/2000）；苏木素染液（ZLI-9610，中衫金桥）；大鼠脑钠素：脑钠尿肽（BNP）试剂盒（MM-0067R1，酶免）；大鼠心肌肌钙蛋白I（cTn-I）试剂盒（MM-61550R1，酶免）。

1.2.2 实验仪器 高分辨率小动物系统（厂家：加拿大多伦多，VEVO）；显微镜（CX41OLYMPUS）；切片机（2235，Leica）；电热鼓风干燥箱（DHG-9070A，恒科学仪器有限公司）；荧光显微镜（CKX53，OLYMPUS）；紫外分光光度仪（NP80，NanoPhotometer）；蛋白垂直电泳仪（DYY-6C，北京市六一仪器厂）；超高灵敏度化学发光成像系统（ChemiDocTMXRS+，伯乐生命医学产品上海有限公司）；全自动酶标仪（北京六一仪器厂，WD-2102B）。

2 实验方法

2.1 实验分组

1）空白对照组（Control组）；2）阿霉素组（Model组）；3）阿霉素+参芪扶正注射液组（SFI组）；4）阿霉素+右丙亚胺组（DZR组）。

2.2 大鼠心衰模型的建立

1）造模：用生理盐水配制DOX（0.625 mg·mL-1）后进行腹腔注射，每周1次，共6周。除空白对照组外均尾静脉注射配制好的DOX药液（2.5 mg·kg-1），模型+参扶正注射液组注射DOX前30 min尾静脉注射参扶正注射液（每只4 mL），模型+DZR组注射DOX前30 min尾静脉注射DZR（50 mg·kg-1）。取血：先以腹腔注射10%水合氯醛溶液（300 mg·kg-1）进行全身麻醉；再进行取血，用毛细玻璃管平端先沿着鼻侧眼角慢慢滑动至眼球正下方的眼皮内，左手微微顺时针旋转，使大鼠头部相对位置微向右下偏转，使得玻璃管刺入时对着大鼠口腔方向，找准位置后，右手及毛细管保持不动，将毛细玻璃管刺入后快速拧搓毛细管，进一步破坏内眦静脉丛，加快出血速度，最后接住流出血液。2）取样：各组大鼠腹腔注射10%水合氯醛（350 mg·kg-1）麻醉后腹主动脉取血处死。3）取材：打开大鼠胸腔取出心脏组织置于福尔马林中固定保存，后石蜡切片后进行HE染色，剩余心肌组织冰冻保存用于WB检测。

2.3 HE染色

取出大鼠心肌组织以流水冲洗数小时后以不同浓度梯度（70%、80%、90%）乙醇溶液脱水；后置于纯酒精、二甲苯等量混合液中至透明为止（二甲苯Ⅰ15 min、Ⅱ15 min）；再放入二甲苯和石蜡各半的混合液15 min、放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡各50～60 min后进行石蜡包埋、切片、烤片，然后脱蜡及水化；将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色3 min，盐酸乙醇分化液分化15 s，用流水稍洗后置于返蓝液中返蓝15s，流水冲洗后以伊红染色3 min，流水冲洗后进行脱水、透明、封片、镜检，则完成此步骤。

2.4 TUNEL检测

依次进行以下实验步骤：将组织切片入放入65℃烤箱中烤2 h进行烤片；将切片在二甲苯放置10 min，更换二甲苯再放置10 min以脱蜡；将切片依次放入100%乙醇、100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇和纯化水中各5 min进行水化；将切片移入湿盒中，每个样本上滴加50 ug·mL-1ProteinaseK工作液，37℃反应30 min以修复；DPBS充分洗涤3次，每次5 min，把蛋白酶K洗涤干净后进行TUNEL检测：用吸水纸吸掉组织周围的PBS，每张玻片滴加足够量的TUNEL检测液，45℃避光孵育2 h（湿盒内保持湿润，以尽量减少TUNEL检测的挥发）；再以PBS洗涤3次，每次5 min；最后用吸水纸吸干玻片上的液体，用抗荧光淬灭封片后荧光显微镜下观察。呈现结果：细胞核为蓝色荧光，凋亡细胞为红色荧光。

2.5 Western blot检测

取各组大鼠心肌组织细胞加入裂解液，放冰上裂解30 min后，4℃，以10 000 rpm/min离心10 min，小心吸取上清，即可获得总蛋白。根据BCA试剂盒测定蛋白浓度。蛋白变性，上样，进行十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳1～2 h，后湿法转膜30～50 min。一抗溶液孵育，4℃过夜；二抗溶液中室温孵育1～2 h。在膜上滴加ECL曝光液，在凝胶成像系统中曝光。用“Quantityone”软件分析各抗体条带灰度值。

2.6 ELISA检测

取各组大鼠血清样本，试剂和样本都先恢复到室温，设置标准品孔、样本孔、空白孔，按照ELISA试剂盒说明书中所述方法操作，分别检测样本血清中BNP、肌钙蛋白I（cTnI）的表达情况。

2.7 统计学方法

所有数据均采用SPSS 19.0进行统计分析，经t检验判定显著性差异，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 HE染色结果

如图1所示，Control组心肌细胞形态、胞质、间质均正常，肌纤维排列整齐，胞质丰富均匀。与Control组比较，Model组心肌细胞水肿，轻微纤维化，嵴断裂溶解伴有出血及炎性细胞浸润，肌质网扩张；对比于Model组，SFI组及DZR组肌纤维排列均整齐，出血量减少；SFI组与DZR组相比，DZR组肌质网收缩，治疗后情况较好。

图1 大鼠心肌组织HE染色结果

3.2 TUNEL检测结果

如图2所示，与Control组比较，Model组的心肌组织凋亡细胞明显增多；与Model组比较，SFI组及DZR组心肌组织凋亡细胞均明显减少。

图2 大鼠心肌组织Tunel检测结果

3.3 ELISA检测结果

如图3所示，与Control组比较，在6、9周Model组c-Tnl、BNP表达增加；与Model组对比，SFI组及DZR组6、9周给药后的c-Tnl、BNP均明显降低（P＜0.05），其中c-Tnl在给药6周下降更明显，BNP在给药9周后下降更明显；6、9周给药后SFI组与DZR组间c-Tnl、BNP含量无显著性差异（P＞0.05）。

图3 大鼠血清中c-Tnl、BNP的表达结果

3.4 Western blot检测

如图4所示，1）Akt、P-akt：与Control组比较，Model组的心肌组织Akt、P-akt的蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）；与Model组比较，SFI组心肌组织Akt、P-akt的蛋白表达水平升高（P＜0.05），DZR组AKT蛋白表达水平升高、P-akt蛋白表达水平下降（P＜0.05）；DZR组的AKT、P-AKT蛋白表达水平均较SFI组低（P＜0.05）。2）Bcl-2：与Control组比较，Model组的心肌组织Bcl-2的蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）；与Model组比较，SFI组心肌组织Bcl-2的蛋白表达水平升高（P＜0.05），DZR组的Bcl-2显著上调（P＜0.05）；与SFI组相比，DZR组下降（P＜0.05）；3）Bax：与Control组比较，Model组的心肌组织Bax的蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）；与Model组比较，SFI组心肌组织Bax蛋白表达水平升高（P＜0.05），DZR组的Bax蛋白表达水平下降（P＜0.05），与SFI组相比，DZR组的Bax显著下降（P＜0.05）；4）GSK3β、p-GSK3β：与 Control组比较，Model组的心肌组织GSK3β、p-GSK3β的蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）；与Model比较，SFI组心肌组织GSK3β、p-GSK3β的蛋白表达水平增高（P＜0.05）；DZR组的GSK3β、p-GSK3β的蛋白表达水平增高，无明显差异；与SFI组比较，DZR组的GSK3β、p-GSK3β的蛋白表达水平显著下降（P＜0.05）。

图4 大鼠心肌组织中Akt，P-akt, GSK3β、p-GSK3β、Bcl-2、Bax的蛋白表达结果

4 讨论

阿霉素等蒽环类化疗药物引起心脏毒性甚则出现急、慢性心衰，已被众多临床研究报道[10]，尽管DZR是目前临床上用于减轻蒽环类抗生素化疗引起的心肌毒性的一种常见辅助用药，但其存在骨髓抑制、增大继发性肿瘤发生等风险且费用高[11]。因此，作为扶正祛邪的代表药物，参芪扶正注射液在肿瘤性疾病如白血病、肺癌、乳腺癌等治疗中，凸显出其在防治蒽环类化疗药物所致心脏毒性上的优势[12-13]。本研究发现，阿霉素（DOX）诱导SD大鼠发生心脏毒性改变，具体表现为心肌细胞水肿，轻微纤维化，嵴断裂溶解伴有出血及炎性细胞浸润，肌质网扩张等急性心衰的病理变化，而接受参芪扶正注射液（SFI）及右丙亚胺（DZR）治疗后，急性心衰模型大鼠心肌病理改变均有不同程度好转，心肌组织凋亡细胞明显减少。研究表明，c-Tnl、BNP是心衰诊断和预后相关的血液生物标志物[14]，其中c-Tnl是患者心脏死亡率的独立预测因子[15]，BNP是一种具有多种生理特性的血管活性肽[16]，对心脏结构、血流动力学的影响广泛[17]。因此，治疗前后检测c-Tnl、BNP对于评估心肌损伤、心衰程度具有重要意义，本研究对比发现，经SFI治疗6周、9周后c-Tnl、BNP均较治疗前降低，且与DZR比较无明显差异，但鉴于样本量有限，尚不能说明二者疗效相似。

进一步从参与心肌细胞凋亡关系密切的因子入手，对其作用机理进行探究。发现SFI及DZR组AKT蛋白表达水平均升高，SFI组更明显，且SFI组心肌组织GSK3β、p-GSK3β的蛋白表达水平较Model组及DZR组均增高。究其原因，与PI3K/Akt信号通路关系密切。PI3K/Akt信号通路激活导致的细胞凋亡、炎症和自噬的诱导是阿霉素等蒽环类药物引起的心脏损伤的原因之一[18]，课题组前期发现，参芪扶正注射液防治蒽环类药物引起的心脏毒性的具体生物学功能表现在对RNA聚合酶II启动子转录的正向调控、DNA转录、细胞外间隙及细胞连接的调控、类固醇激素受体活性的调节等多个方面[9]。Akt（蛋白激酶B）作为PI3K/Akt通路中重要的信息传递分子，正常情况下位于细胞浆内，当其被活化的磷酸肌醇依赖的蛋白激酶（PDK）激活后，由细胞浆转移至细胞膜内侧，被磷酸化为p-Akt，p-Akt进入细胞核，发挥对下游靶蛋白的调控。糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β），GSK3β是位于其下游的重要靶点蛋白，其是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，普遍存在于各种真核生物细胞中，能作用于多种底物，GSK3β在缺血性心脏病和缺血再灌注病理中具有潜在重要性[19]。PI3K/Akt 信号通路中的 p-Akt使得 GSK3β Ser9 位点磷酸化，形成p-GSK3β，则GSK3β丧失生物学活性。GSK-3β在细胞内可广泛参与对各种细胞功能的调节，包括控制细胞增长周期及凋亡、增加线粒体膜通透性、维持细胞骨架完整性等，还可通过参与Wnt信号通路，与β连环蛋白（β-catenin）协同调控心肌肥厚相关基因的表达[20]，达到抑制心衰心室重构的作用。当PI3K/Akt 信号通路被激活，下游靶蛋白GSK3β丧失对心肌细胞的正向调节作用，出现心肌细胞肥大及数量减少、心肌细胞骨架结构破坏、心肌纤维化等病理改变[21]，继而影响心脏功能的正常发挥，出现心力衰竭症状。SFI组方为黄芪、人参二味中药，药理研究发现，黄芪中主要成分黄芪多糖可激活PI3K/Akt信号通路，促进骨髓干细胞的增殖分化，上调PI3K、AKT mRNA的表达，并增加pPI3K和p-AKT的蛋白含量[22]；人参皂苷Rh2（ginsenoside Rh2，Rh2）是人参的主要成分之一，Rh2通过调控PI3K/Akt信号通路促进骨髓间充质干细胞增殖，增加PI3K、p-Akt表达[23]，与本研究中部分结论一致，SFI可通过对PI3K/Akt信号通路的调控，上调Akt、p-Akt、GSK3β、p-GSK3β水平，发挥抗心衰作用。

此外，本研究中参芪扶正注射液治疗后可改善模型大鼠心肌细胞的出血、水肿、炎细胞浸润，可降低心肌细胞凋亡率。继而从抗凋亡B淋巴瘤-2（Bcl-2）、促凋亡Bcl-2相关X蛋白（Bax）这一对凋亡相关蛋白探究其作用机理。Bcl-2与Bax作为线粒体外膜通透的效应者，被称为细胞凋亡的门户，在凋亡刺激下，它们在线粒体外膜(MOM)被激活并寡聚，介导其通透性，这被认为是细胞凋亡的关键步骤，二者共同调控细胞的“生死”[24]。Bcl-2还可通过阻止Bax释放细胞色素C，从而抑制其对细胞的诱导凋亡作用[25]。本研究中，SFI组心肌组织Bcl-2的蛋白表达水平较Model组及DZR组升高，从而发挥抗细胞凋亡的作用，然而，其Bax蛋白表达水平亦升高，推测原因，细胞凋亡或存活，并非单纯由Bcl-2或Bax决定，而是由二者共同决定，主要依赖于Bcl-2和Bax的数量比值，Bcl-2可与Bax形成二聚蛋白复合体，调控细胞存亡。当Bcl-2过剩时，Bax/Bcl-2二聚体形成，Bax无法发挥其促凋亡作用，故细胞受保护而存活；当Bax过剩时，Bax二聚体形成，细胞启动程序性凋亡机制，同时过多的Bax可通过加速电压依赖性离子通道促进细胞色素C从线粒体释放，细胞色素C亦发挥诱导细胞凋亡作用，引起细胞的死亡[26]，SFI通过加速Bax/Bcl-2二聚体的形成，发挥对心肌细胞的保护作用。

从中医角度观之，阿霉素是临床常用的化疗药物，具有“双刃剑”作用。在治疗中发挥攻邪疗效的同时，亦对正气造成了一定程度的损伤，因此，阿霉素等化疗药物的临床应用中，如何保障其在祛除邪毒的同时降低其对正气的损伤是值得探究的课题。在本研究中，重点关注的是阿霉素对心脏的影响，其攻伐正气，尤损于心。中医脏腑理论中，心乃君主之官，心气受损，心阳不振，则出现气虚、心悸、乏力等证，日久气血阴阳俱虚，损及其它脏腑，出现一派虚证。参芪扶正注射液，顾名思义，以扶正为主要功效，恰弥补了化疗药物祛邪伤正的不足，宏观表现在改善阿霉素用药后出现心气虚为主的临床症状上，微观则体现在作用于PI3K-Akt信号通路相关的某个或数个靶点上。

综上所述，本研究通过从病理、蛋白等不同角度探索参芪扶正注射液对大鼠阿霉素急性心衰模型的影响，通过与Model组、DZR组对比，得出参芪扶正注射液在改善SD大鼠急性心衰上效果较佳，但样本量有限可能对结果造成一定影响，课题组后期将扩大样本量，进一步验证。SFI发挥疗效的作用机制可能是通过调控PI3K-Akt信号通路，上调Akt、P-akt、GSK3β及 p-GSK3β蛋白的表达，并作用于Bcl-2、Bax，发挥抗细胞凋亡作用，从而改善心肌损伤及延缓心衰，为进一步揭示参芪扶正注射液对急性心衰的影响，本研究后期将不断完善，宏观层面可从前后心脏射血、心输出量、心功能等指标上比较，微观层面可从PI3K-Akt及与之相关的其它信号通路进行深入挖掘。