杨振菲,马志杰，2，陈生梅，白诗睿，李广祯，李文浩，李剑

(1.青海大学畜牧兽医科学院，西宁 810016;2.青海省高原家畜遗传资源保护与创新利用重点实验室，西宁 810016;3.青海省祁连县畜牧兽医站,祁连 810400)

牦牛是生活在青藏高原及其毗邻高山、亚高山高寒地区的特有牛种,中国现有牦牛1500多万头，是世界上拥有牦牛数量和品种(类群) 最多的国家[1]。牦牛适应能力强，在遗传上是一个极为宝贵的基因库，它能在空气稀薄、气候寒冷、牧草生长周期短的高寒生态环境中生长繁殖，并为牧民提供肉、乳、皮毛等生活必需品，是青藏高原牧民的重要生活和经济来源[2]。祁连县隶属于青海省海北藏族自治州，位于祁连山中部的群山峻岭和山间盆地之中，县境高山、丘陵、盆地和河谷错纵分布，地貌类型多样，适宜农牧业生产,境内平均海拔3169m，年平均气温1℃，全年无绝对无霜期，降水少，日照时间长，气候干燥，年降雨量272.7～514mm，属典型的高原大陆性气候[3]。畜牧业是该县的主要产业之一，牦牛是其宝贵的动物遗传资源和优势种畜。据统计,祁连县饲养牦牛达17万头,占全县各类牲畜总数的14%，年产牛肉2766t、牛皮3.5万张[4]。

线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)具有进化速率快、分子结构简单、重组性率低等特点，是开展哺乳动物遗传多样性、起源进化和分类等研究常用的分子遗传标记之一。mtDNAD-loop区是线粒体基因组中变异最丰富的区域，且在物种分子进化和分类中存在有效的变异信息，对探究动物的系统发育、遗传分化、分类地位等具有重要作用[5]。在牦牛的母系遗传研究中,赖松家等[6]测定分析了我国5个牦牛品种的mtDNAD-loop区全序列，共确定了24种单倍型,各品种总的单倍型多样度为0.9697,单倍型网络关系聚为2个聚类簇,表明牦牛D-loop区遗传变异丰富，我国牦牛有2个母系起源或者有2个主要的驯化点。郭松长等[7]通过分析我国10个家牦牛品种D-loop区部分序列的遗传变异，表明家牦牛具有丰富的母系遗传多样性，且牦牛品种间遗传多样性水平存在较大差异，其中环湖牦牛的单倍型多样性最高,达0.985，而巴州牦牛单倍型多样性最低,为0.800，推测青海省可能为家牦牛的驯化中心；聚类分析显示我国家牦牛存在2个聚类簇，推测有2个母系起源。Wang ZF等[8]对405头我国家牦牛与47头野牦牛D-loop区进行综合分析，结果表明我国家牦牛、野牦牛的单倍型多样度分别为0.916和0.967；系统发育分析表明牦牛存在3个母系支系，其中Ⅰ、Ⅱ支系被家、野牦牛所共享，只有少量野牦牛分布于第Ⅲ支系。曾玉峰等[9]利用微卫星DNA和mtDNA两种分子标记探究了甘肃省境内6个牦牛品种/群体(玛曲、碌曲、夏河、天祝和肃南牦牛)的遗传多样性,对其240头牦牛的mtDNA D-loop序列测序分析共确定41种单倍型，单倍型多样度在玛曲、碌曲牦牛群体中都较高，其值均在0.900以上，但在天祝白牦牛群体中较低(0.662)；构建的NJ系统发育树中6个牦牛群体分为明显的2支，表明其有2个母系起源。在西藏牦牛的母系遗传研究中，宋乔乔等[10]对8个西藏牦牛群体(即日多、类乌齐、丁青、错那、隆子、仲巴、聂荣和申札牦牛)共328头个体的mtDNA D-loop区序列进行群体遗传分析，共检测出91种单倍型,平均单倍型多样度为0.884，核苷酸多样度为0.010,表明西藏牦牛具有较丰富的遗传多样性， 但和野牦牛的遗传多样性相比较低；系统发育分析显示西藏牦牛可分为2大类。在四川牦牛的母系遗传研究中，官永强等[11]对四川省的4个牦牛品种(即昌台、金川、木里和麦洼牦牛)与西藏、青海、新疆等地的品种(类群)以及野牦牛进行综合分析，结果显示昌台牦牛在四川4个品种中具有最高的单倍型多样度(0.883)和核苷酸多样度(0.017);进化树分析显示四川牦牛及其他地区牦牛品种(群体)具有明显的2个支系,昌台牦牛和金川牦牛与九龙、达日、大通、天祝、西藏、玉树牦牛具有较近的遗传关系。Yue XP等[12]对我国13个家牦牛、野牦牛品种(群体)共742条D-loop序列进行综合分析，表明在家牦牛中大通牦牛单倍型多样度最高(0.945)，而环湖牦牛的单倍型多样度最低(0.785)。李瑞哲等[13]通过D-loop区序列变异对雪多牦牛的母系遗传多样性及遗传结构进行分析，发现雪多牦牛单倍型多样度为0.900，核苷酸多样度为0.012，且有2个聚类支系，表明雪多牦牛具有丰富的母系遗传多样性，拥有2个母系起源。李广祯等[14]对31条门源白牦牛和235条天祝白牦牛的D-loop序列进行了综合分析，共确定了56种单倍型，其中门源白牦牛拥有特有单倍型7种,天祝白牦牛包含特有单倍型43种；天祝白牦牛单倍型多样度(0.946)高于门源白牦牛(0.862)，但均由2个母系支系组成,提示白牦牛有2个母系起源。Wang XD等[15]对青海省4个牦牛品种(群体)(即雪多、环湖、祁连和玉树牦牛)共86头个体线粒体基因组进行了测序，结合国内其他牦牛品种(群体)相应序列对牦牛母系遗传多样性及系统发育进行了分析，表明雪多牦牛的单倍型多样度最高(0.992)，而环湖牦牛的单倍型多样度最低(0.905)，进一步证实牦牛由3个不同的母系支系组成，且发现雪多牦牛和野牦牛少量个体共存于第3个母系分支。

综上所述，当前研究者已基于mtDNA序列变异对我国多个牦牛品种(群体)进行了母系遗传多样性、群体结构及系统发育等分析[6-15]。尽管当前已有基于小样本对祁连牦牛母系遗传多样性及系统发育分析的研究报道[15]，但其不足以准确地反映其母系遗传多样性水平和群体结构组成。鉴于此，本研究基于较大样本量对祁连牦牛mtDNA D-loop区序列遗传变异进行系统分析，深入探究其母系遗传多样性水平、群体遗传结构组成及母系遗传背景，以期为今后开展祁连牦牛的保种和选育研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1样品采集、基因组DNA提取与Genbank中数据下载

采用颈静脉采血法在青海省祁连县默勒镇共采集33头牦牛的颈静脉血样，采样前询问牧户有关牦牛群的选育背景信息并查阅系谱记录，采用分户采样方式，确保样品间无亲缘关系且具有代表性。使用血液基因组DNA提取试剂盒(艾德莱生物科技有限公司，北京)提取基因组DNA，后-20℃保存备用。从Genbank数据库中下载已报道的22条祁连牦牛mtDNAD-loop序列(GenBank No.∶MW414121-MW414142)用于后续综合分析。

1.2引物合成、PCR扩增和测序

参照野牦牛研究中运用的引物信息[16]，由上海生工生物工程有限公司合成1对引物用以扩增祁连牦牛的mtDNA D-Loop区序列，其中上游引物(PF)为:5＇-GTAAAGAGCCTCACCAGTAT- 3＇，下游引物(PR)为:5＇-TCCTCTAGCCATTGACTAT-3＇。

PCR反应体系(25μL)为：2×Prime STAR Max Premix (上海宝生物公司) 12.5μL，上、下游引物各1μL，基因组DNA为1μL，超纯水9.5μL，共计25μL。PCR反应程序为：95℃预变性4min；95℃变性1min，62℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；后72℃延伸10min。对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，后送胶回收纯化产物至北京擎科生物有限公司进行测序。

1.3数据处理与分析

将测序结果使用Chromas 2.3软件进行校对，后用BioEdit7.2.5软件进行多序列比对分析，再用DnaSP5.10.01、Arlequin3.11软件得到祁连牦牛群体的多态位点和单倍型数目，确定各单倍型(单倍型组)的频率，计算群体的单倍型多样度和核苷酸多样度大小以揭示其遗传多样性水平和群体结构组成。用Mega5软件中的邻接法(Neighbor-Joining，NJ)构建单倍型(组)间的系统发育关系，以揭示祁连牦牛的母系支系组成和遗传背景。

2 结果与分析

2.1祁连牦牛mtDNA D-loop区遗传变异分析

对33条本研究测定的序列和22条Genbank中下载的序列共55条祁连牦牛的mtDNA D-loop区序列进行多序列比对分析，获得有效分析序列长度为692 bp,其中T、C、A、G四种核苷酸的含量分别为28.03%、24.49%、32.25%和15.23%，A+T含量为60.28%，G+C含量为39.72%。序列比对分析排除2处插入/缺失后共检测到33处多态位点，占所分析序列长度的4.77%。在33处多态位点中，3处(即247、314和440位点)为单一多态位点，占分析序列长度的0.43%；30处为简约信息位点，分别为109、116、134、141、157、172、187、193、220、248、249、255、256、266、275、292、295、308、309、310、316、325、328、333、355、390、391、397、500和538位点，占分析序列长度的4.34%。所有突变位点均为两核苷酸之间的变异(图1)。

“.”代表与H1单倍型序列中的核苷酸相同；N代表分享同一种单倍型的个体数；Hg代表单倍型组类型图1 祁连牦牛mtDNA D-loop区17种单倍型序列核苷酸变异、频率及单倍型组类型

2.2祁连牦牛母系遗传多样性分析

55条祁连牦牛mtDNA D-loop区序列分析共确定了17种单倍型，其中单倍型H2由19个个体共享，为优势单倍型，单倍型H4、H6和 H7分别由6、5、7个个体共享，单倍型H12由3个个体共享,单倍型H10、H11和H13均由2个个体共享，其余的单倍型均只在一个个体中出现。计算结果表明，祁连牦牛群体的单倍型多样度为0.850±0.037，核苷酸多样度为0.016±0.008,平均核苷酸差异K值为8.04。

将祁连牦牛的遗传多样性指数值大小与已报道的野牦牛群体及我国其他17个家牦牛品种相应数值进行比较分析(表1)，结果表明：相比野牦牛及大通、青海高原、天祝等其他家牦牛品种，祁连牦牛群体单倍型多样度值(0.850)和核苷酸多样度值(0.016)均较低，表明祁连牦牛遗传变异不太丰富，母系遗传多样性水平较低。

表1 祁连牦牛与野牦牛及我国17个家牦牛品种母系遗传多样性指数值大小比较

2.3祁连牦牛系统发育分析

以美洲野牛(GenBank No.:EU177871)为外群,基于NJ法构建祁连牦牛群体不同单倍型(组)间的系统发育关系(图2)。聚类结果表明：祁连牦牛的17种单倍型共聚为2个分支，其中单倍型H2、H4、H5、H6、H8、H9、H10、H14、H16和H17聚为一支(即支系Ⅰ),单倍型H1、H3、H7、H11、H12、H13和H15聚为另一支(即支系Ⅱ)。17种单倍型分别属于A、B、C、D和E 5种单倍型组，分别占35%(6/17)、12%(2/17)、29%(5/17)、12%(2/17)和12%(2/17)。

图2 基于NJ法(i和ii)构建的祁连牦牛母系单倍型(组)间系统发育关系及支系组成

3 讨论

遗传多样性是物种进化与分化的基础，是组成生物多样性不可或缺的一部分。单倍型多样度和核苷酸多样度大小能够反映动物群体遗传变异的丰富程度，进而可评定其遗传多样性水平。在一个动物群体中，如果它的单倍型多样度和核苷酸多样度值越高，则它的遗传变异越高，遗传多样性就愈加丰富。在青海牦牛的父系群体遗传研究中,Ma ZJ等[22]对9个青海牦牛品种(群体)(即唐古拉山、天峻、曲麻莱、祁连、郭勒木德、岗龙、雪多、环湖和大通牦牛)的Y染色体单倍型多样性及群体遗传结构分析表明，祁连牦牛的父系遗传多样性较低(0.280±0.100)。在本研究母系遗传研究中,祁连牦牛群体的单倍型多样度为0.850±0.037，核苷酸多样度为0.016±0.008,表明其母系遗传多样性也较低，这与Ma ZJ等[22]对其父系遗传的研究结果一致。在先前对野牦牛的母系遗传研究当中，野牦牛的单倍型多样度在0.957～0.967之间[7-8，12.16]，拥有丰富的母系遗传多样性。而我国部分家牦牛的母系遗传多样性分析表明：家牦牛品种(群体)间存在较为显著的遗传分化，无明显的谱系地理结构，遗传多样性丰富，其单倍型多样度在0.621～0.985之间[6-8,11-14，16-21]。在本研究中，祁连牦牛群体的单倍型多样度(0.850±0.037)和核苷酸多样度(0.016±0.008)值与上述其他牦牛品种(群体)(如野牦牛及环湖、大通、青藏高原、玉树、雪多、金川、麦洼、昌台、九龙、木里、嘉黎、天祝、甘南、帕里、类乌齐、斯布、巴州、中甸牦牛)相比，其单倍型多样度和核苷酸多样度值均较低，进一步表明其遗传变异较小，母系遗传多样性水平较低。究其原因，可能与祁连牦牛的生存环境、选育程度、遗传漂变等因素有关，其具体原因有待今后作进一步深入研究。

家畜的起源和系统发育研究可以明确其进化历史和遗传背景，对其选育、保护和开发利用至关重要。先前，大多数关于我国家、野牦牛品种(群体)的系统发育研究显示，牦牛拥有2个母系支系，推测其有2个母系起源[6，7,9-11,13，14，18-20]。然而，近年来部分系统性的研究表明，家牦牛、野牦牛均拥有3个母系支系，推测牦牛有3个母系起源。如Wang ZF等[8]检测了405头家牦牛与47头野牦牛mtDNA D-loop区及蛋白编码基因序列变异，聚类分析显示牦牛有3个高度分化的遗传分支，其中2个分支中有家、野牦牛的分布，而另一个分支中仅有少量野牦牛分布。Wang XD等[15]对青海省4个牦牛品种(群体)共86头个体线粒体基因组进行测序，结合国内其他牦牛品种(群体)相应序列对其系统发育进行分析，进一步证实牦牛由3个不同的母系支系组成，且发现雪多牦牛和野牦牛少量个体共存于第3个母系分支。与此同时，Ma ZJ等[16]基于野牦牛mtDNA D-loop区和全线粒体基因组序列构建系统发育树，结果显示野牦牛聚为3个母系支系，表明其有3个母系起源。在本研究中，祁连牦牛的系统发育分析聚类关系图中(图2)，17种单倍型分为2个大的母系支系，说明祁连牦牛具有2个母系起源，这与先前研究者对其他家牦牛品种(群体)母系遗传背景的研究结果相似[6-7,9-11,13-14，18-20]。