孙怡，张腾，吕波，李春，2

（1 北京理工大学化学与化工学院生物化工研究所，北京 100081； 2 清华大学化学工程系生物化工研究所，北京 100084）

引 言

在当今可持续发展的大背景下，以可再生生物质为原料的绿色生物制造得到迅速发展，涵盖了能源、材料、药品、食品、化妆品等多个领域，旨在取代依赖石油资源的生产方式[1]。微生物细胞工厂是生物制造技术的主力军[2]，已成功应用于天然产物[3]、生物燃料[4]和大宗化学品[5]等的合成,极大程度地解决了由于生产效率低或难以化学合成等原因而无法工业化生产的问题[6]。

对微生物细胞工厂进行工程化设计，可实现各类化合物的合成及高产。利用代谢工程和发酵优化等方法，国外的学者们在大肠杆菌中实现顺式-粘康酸的高产[7]，在酿酒酵母中实现大麻素类似物的合成[8]；而国内的学者们也实现了在枯草芽孢杆菌中N-乙酰神经氨酸（NeuAc）的高产[9]和工程酿酒酵母中α-香树脂醇的高产[10-11]。

在对微生物细胞工厂进行工程改造时，微生物细胞由于受到代谢负担、化合物毒性和胁迫环境等不利影响，通常会导致效价和生产率降低[12]。此外，目前产生的代谢物主要使用液相色谱、气相色谱及质谱等分析方法来测量，这种方法耗时耗力，且产量较低[13]。面对这些棘手的问题，亟需提高微生物细胞工厂的精细调控，一方面要通过复杂的调控网络“动态”调节细胞代谢，维持旺盛的生长，抵御环境波动，而且要消除过量代谢物中间体和前体的产生，使中间体底物和辅因子向所需产物进行有效转化；另一方面也要进行高通量筛选，促进化合物的高得率、高浓度和高生产率[13-15]。

近年来，在细胞中构建的生物传感器(biosensor)已成为监测和调节微生物细胞工厂的有力工具（图1）。当它与高通量筛选(high throughput screening,HTS)设备相结合，可以加速基因元件、代谢途径和底盘细胞的优化[16-18]；当它与目标化合物合成途径相结合，可实现代谢途径的反馈调节，以及化合物合成与细胞生长的耦合或解耦[19-20]。因此使用胞内生物传感器可以提高微生物细胞工厂的精细调控，解决微生物细胞工厂中目标化合物生物合成的关键瓶颈问题[6,21-23]。

图1 胞内生物传感器的设计与高效细胞工厂的构建Fig.1 Design of intracellular biosensor and construction of high-efficiency cell factory

本文将从转录、翻译及蛋白质水平对细胞内生物传感器进行分类并阐明其工作原理，也将介绍胞内生物传感器提高微生物细胞工厂精细调控的应用，及其设计和应用所面临的挑战。随着胞内生物传感器功能的开发，其将对微生物细胞工厂的精细调控起到更重要的作用。

1 胞内生物传感器的分子基础

胞内生物传感器(intracellular biosensor)指的是设计的细胞对某种物理、化学或生物信号进行特异性感应并能输出可检测信号的生物装置。如图2所示，胞内生物传感器具有两个模块，一是“传感”模块，用于检测细胞外或细胞内产生的物质的存在，即传递信号；二是“报告”模块，将检测到的信号转换成输出信号进行报告。根据不同需求，可以选用光学信号，如荧光(gfp、deGFP、rfp、mScarlet)、比色(lacZ)和生物发光(lux、luc、NanoLuc)[24-25]，也可以选用电化学信号[26]进行输出报告。

图2 胞内生物传感器的工作原理Fig.2 Working principle of intracellular biosensor

设计、构建和优化胞内生物传感器的关键元件，如启动子、转录调节因子、5′和3′非翻译区(UTR)等，可以调节传感器的灵敏度、检测范围和响应严谨性，提高其响应效果[27-28]。

2 胞内生物传感器的分类及工作原理

将代谢物的浓度转化为可测量输出的生物传感机制越来越多地用于细胞工程和合成生物学[20,29]。根据传感模块，即调节元件的不同，可大致将胞内生物传感器分为三大类，分别是转录调节元件作为胞内生物传感器、翻译调节元件作为胞内生物传感器及蛋白质作为胞内生物传感器（表1）。这三类生物传感器既可以直接从天然元件中挖掘，也可以通过工程改造现有元件来获得新的特异性或其他的特性。

表1 胞内生物传感器的分类及相关举例Table 1 Classification of intracellular biosensors and related examples

2.1 转录调节元件作为胞内生物传感器

2.1.1 基于启动子的生物传感器 在自然界中，细胞中具有进化成能感应应激或代谢物特异性应答的启动子。基于启动子的传感器由不同的元件组成:传感元件(启动子)和报告基因[图3(a)]。识别合适的启动子通常是最关键的步骤。当中间代谢物积累到毒性水平时，细胞将出现自然应激反应，启动子活性改变即为其中之一，通过这一现象能够鉴定新的启动子。例如，通过全基因组和转录组分析在大肠杆菌中鉴定了对法尼基焦磷酸(FPP)有响应的启动子，这些启动子被用来控制中间体的积累并提高吗啡二烯的最终浓度，最终使吗啡二烯的产量提高了两倍，消除了对昂贵诱导剂的需求，减少醋酸盐积累并改善大肠杆菌的生长[30]。

除了对代谢物进行应答，启动子还可对酸[31]、温度[50]、糖或糖苷类[32]以及细胞密度[33]进行响应。例如，国内学者在黑曲霉中，通过转录分析鉴定了一个低pH诱导型启动子Pgas，该启动子的强度与酸的类型和酸离子浓度无关，只与酸碱度有关，并在pH小于5 时能促进衣康酸的表达，使其最终浓度为4.92 g/L[34]；在酿酒酵母中鉴定了两个启动子PHSP12和PHSP26，其能响应高温和乙酸胁迫[35]。启动子是在转录水平上实现基因高效、精准表达调控的最关键元件之一，因而被广泛使用。

2.1.2 基于转录因子的生物传感器 转录因子可以根据特定的代谢物来调节基因表达，并被广泛用于构建胞内生物传感器[51]。如图3(b)所示，当被代谢物与转录激活因子特异性结合时，转录激活因子中的构象变化使其能够结合启动子区域中的特定DNA 序列，进而增强报告基因(例如荧光蛋白基因、调节开关或选择标记)的表达；而代谢物与转录抑制因子特异性结合时[图3(c)]，转录抑制因子中的构象变化将其从启动子中释放出来，并允许报告基因的表达。这类生物传感器通过设计可以提供高灵敏度和宽响应范围，例如国内学者对转录因子FapR的结合位点进行分析和重新设计，从而扩大了酿酒酵母中丙二酰辅酶A 生物传感器的动态响应范围[36]；基于转录因子的生物传感器也可以将细胞生长和生产相结合，利用建模和实验数据的比对淘汰掉假阳性菌株，从而筛选出目标化合物产量最优菌株，例如在谷氨酸棒杆菌中通过在两个生长调节基因pfkA 和hisD 上游整合基于Lrp 转录激活因子的生物传感器，使谷氨酸棒杆菌的生长与支链氨基酸在细胞内的浓度相结合，在降低菌株生长速度的同时大量生产L-缬氨酸[37]，在钝齿棒杆菌中利用转录因子ArgR及报告基因SacB构建响应L-精氨酸的生物传感器，使得高L-精氨酸产量的菌株可以在10%蔗糖筛选中存活，目前获得L-精氨酸的最高产量为95.5 g/L[38]。

图3 转录调节元件作为生物传感器(a)基于启动子的生物传感器;(b)基于转录激活因子的生物传感器;(c)基于转录抑制因子的生物传感器Fig.3 Biosensors based on transcription regulatory elements(a)biosensor based on promoter;(b)biosensor based on transcription activator;(c)biosensor based on transcription inhibitor

虽然挖掘内源性的转录因子开发胞内生物传感器已经取得成功，但是自然界中已被表征的转录因子数量有限，一种解决方法是采用基因组测序的策略来扩展生物传感器平台库，得到先前未表征的转录因子，例如通过挖掘嗜芳烃新鞘氨醇菌DSM 12444 基因组鉴定出对白藜芦醇有特异响应的转录因子，以此设计的生物传感器不仅能检测细胞中的白藜芦醇，通过改造还能检测同样具有间苯二酚基团的大麻二酚酸[39]；同样通过基因组挖掘，利用共表达网络分析筛选出31 个MYB 家族的转录因子，揭示了其与靶结构基因之间相对特定的调控关系[52]。需要注意的是，设计基于转录因子的生物传感器，即便转录因子是细胞内源的，也通常需要进行过表达[53]。另一种解决方法是利用蛋白质工程等手段对已有的转录因子重新设计，改变其底物特异性，从而构建出响应更多化合物的胞内生物传感器[54]。

2.2 翻译调节元件——“核糖体开关”生物传感器

核糖体开关是mRNA 分子非翻译区(UTR)中的调控元件，与小分子结合后，改变构象，从而影响目标蛋白的翻译。在一个以“核糖体开关”为基础的生物传感器中，由RNA 适体结构域介导，核糖体开关可以通过抑制抗终止子，通过隔离核糖体结合位点翻译来调节转录过程[55]，或通过mRNA 切割进行后转录。这种调控主要是通过与配体或代谢物直接结合的构象变化来实现的(图4)。

图4 “核糖体开关”生物传感器工作示意图(a)通过抑制抗终止子停止转录;(b)通过隔离核糖体结合位点翻译进行转录;(c)通过隔离核糖体结合位点翻译停止转录;(d)通过mRNA切割进行后转录Fig.4 Schematic diagram of the“ribosomal switch”biosensors(a)stop transcription by inhibiting anti-terminator;(b)transcribing by isolating ribosome binding site translation;(c)stop transcription by isolating ribosome binding site translation;(d)post-transcription by mRNA cleavage

核糖体开关已被设计成对感兴趣的目标分子有反应的胞内生物传感器[56-57]。例如，使用特征良好的茶碱适体作为传感元件成功构建响应茶碱的生物传感器[40]，而菠菜RNA 适体，在与3，5-二氟-4-羟基亚苄基咪唑啉酮(DFHBI)[41]结合时能发出绿色荧光，被应用于硫胺素5′-焦磷酸[42]和S-腺苷-同型半胱氨酸[43]生物传感器的开发；有国外学者在大肠杆菌中设计了基于胍基的核糖体开关生物传感器，胍是一种常见的离液剂，既是肥料又是爆炸性化合物的前体。该传感器在胍处理后的4 min 内就能激活细胞中的荧光，这种快速检测活性的能力可维持1.6周[44]。目前，大多数基于RNA的生物传感器已在细菌系统中报道，在酵母中发现的很少，因为在细菌中发现的大多数核糖开关在酵母中不起作用。

2.3 蛋白质作为生物传感器

2.3.1 “G 蛋白偶联受体”生物传感器 G 蛋白偶联受体(G protein coupled receptors, GPCRs) ,也称7 个跨膜受体(7 transmembrane receptors，7TMRs)，是一类跨膜受体系统。该系统可将各种细胞外信号转化为细胞内反应，使其成为细胞内生物传感器工程和开发有潜力的候选对象[58]。如图5(a)所示，当GPCRs 被细胞外信号激活时，GPCR 将与由α、β 和γ 亚基组成的G 蛋白偶联，从α 亚基中分离出β 和γ 亚基的异二聚体，并激活下游效应物。与其他基于蛋白质的生物传感器类似，通用蛋白质识别系统的多功能性质使其广泛用于代谢物检测。然而，基于GPCR 的生物传感器通常仅限于细胞外传感。有国外学者使用挥发性芳香化合物特有的气味受体，构建了一系列基于GPCR 的传感器来检测挥发性芳香化合物丁香酚、香豆素、二氢茉莉酮和苯乙酮[45]。

图5 蛋白质生物传感器工作示意图(a)基于G蛋白偶联受体的生物传感器;(b)双组分系统生物传感器;(c)Förster共振能量转移生物传感器;(d)酶偶联生物传感器Fig.5 Schematic diagram of protein biosensors work(a)G protein-coupled receptor-based biosensor;(b)two-component system biosensor;(c)Förster resonance energy transfer biosensor;(d)enzyme-coupled biosensor

2.3.2 双组分系统生物传感器 双组分系统(twocomponent system,TCS)生物传感器允许微生物感知环境变化或瞄准代谢物。先前的研究表明，双组分系统生物传感器可被设计和工程化为不同应用的胞内生物传感器[59]。典型的TCS 系统包括组氨酸激酶(histidine kinase, HK)和反应调节因子(response regulator,RR)[图5(b)]。环境变化或目标代谢物的存在诱导HK 的自磷酸化，随后磷酰基转移到RR，磷酸化的RR 进一步调节报告基因的表达。HK 是一种跨膜蛋白，HK的C端激酶结构域通常位于胞质溶胶中，其用于刺激感知的N 端结构域可定位于胞质外区室(周质、内膜或外膜，甚至细胞外空间)。氮末端传感器结构域的定位使TCS传感器能够感测不同细胞质或细胞外空间中的代谢物。先前的研究已经表明，TCS 的模块化设计可用于产生具有新效应分子特异性的传感器激酶，并将信息转导至基因表达水平[60]。有国外学者研发了一个响应苹果酸的TCS 生物传感器，通过将来自枯草芽孢杆菌的MalK传感器结构域融合到来自大肠杆菌的EnvZ 激酶结构域构建嵌合体，该传感器可以通过控制ompC 启动子的活性，进而对外部苹果酸的积累产生响应[46]。

2.3.3 “Förster 共振能量转移”生物传感器 基于Förster共振能量转移(FRET)的生物传感器也用于检测细胞内代谢物。通常，FRET 传感器包含一个内部代谢物结合蛋白(metabolite binding protein ,MBP)，两侧是一对供体和受体荧光蛋白(fluorescent proteins, FPs)[图5(c)]。当MBP 结合目标化合物时，有一个构象变化来改变供体和受体FPs的分子内距离，其中来自供体FP 的发射激发受体FP，给出代谢物浓度的可测量辐射指数。青色荧光蛋白(cyan fluorescent protein , CFP)和黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein , YFP)通常用作供体和受体荧光蛋白对。与基于转录因子的生物传感器相比，FRET传感器通过避免基于转录因子的生物传感器在诱导基因表达和信号之间的时滞，具有更快的信号响应。

多年来，FRET 传感器已被开发用于检测广泛的代谢物，如糖[61]、氨基酸[62]、丙酮酸盐[63]、乳酸盐[64]、离子[65]以及氧化还原状态[66]。例如，已发现变构转录因子LghR 能对L-2-羟基戊二酸（L-2-HG）进行特异性响应，而L-2-HG 在各种生理过程例如碳饥饿反应、肿瘤发生和低氧适应中起重要的作用，因此构建感应L-2-HG的FRET传感器，进而可以监测不同生物样本中L-2-HG 的浓度[47]。然而，FRET 传感器由于其相对较低的绝对信号而很少用于筛选[67]。

2.3.4 酶偶联生物传感器 另一种基于蛋白质的胞内生物传感器依赖于酶偶联反应。这种生物传感器利用酶催化反应，可以将目标代谢物转化为可检测的生色和荧光物质[图5(d)]。这种传感器的开发需要相关反应的先验知识。在某些情况下，所需的反应可以一步完成。例如，l-3,4-二羟基苯丙氨酸(l-DOPA)的酶偶联生物传感器是通过在DOPA 双加氧酶的帮助下将l-DOPA转化为黄色荧光色素β-黄嘌呤而开发的[48]。在其他情况下，需要一连串的反应才能形成可检测的分子。例如，木糖或乳酸可以通过酶偶联生物传感器来检测。结果表明，吡喃糖氧化酶和乳酸氧化酶会分别氧化木糖和乳酸，同时产生副产物过氧化氢(H2O2)。H2O2副产物随后被辣根过氧化物酶氧化，导致产生易于检测的荧光化合物间苯二酚[49]。为了创建酶偶联生物传感器，也有几种情况结合使用酶和化学反应。最近，通过结合胞苷脱氨酶(CDA)和靛酚法开发了胞苷的酶测定法[68]。

3 胞内生物传感器对微生物细胞工厂的精细调控

现如今，谷氨酸棒杆菌、酿酒酵母、大肠杆菌、米根霉、乳酸杆菌等微生物已被广泛用作生产有价值化合物的细胞工厂。尽管已经对各种微生物进行了评估，能够进行高值化合物的可持续生物转化，但使用细胞工厂的目的应该是建立廉价和高产率的生物过程，并且对细胞生长无害。为了实现这一点，高效细胞工厂的设计需要在宿主生物体中进行合成途径的监测与调节，以优化目标化合物的生产率。

生物传感器是一种非常有利的工具，如表2 所示，当其与可读输出(如荧光)或抗生素相结合，开发成高通量筛选平台，这种方法通常用于选择高产遗传变异体或确定导致产品高浓度的工艺条件[81]。而当应用于动态调控代谢途径时，生物传感器能精准探测细胞的代谢状态并根据情况将代谢物的产生与细胞生长解耦或耦合[19-20]，从而补偿工程化途径的代谢活性，并提高工程化细胞工厂的整体生产率和适应性[82]。

表2 胞内生物传感器应用于微生物细胞工厂的经典案例Table 2 Classic cases of intracellular biosensors applied to microbial cell factories

3.1 胞内生物传感器应用于细胞工厂的高通量筛选

微生物细胞工厂生产化合物的进化工程需要有效的筛选方法来测试大量的突变体库。当通过改变颜色、荧光、大小、更高的细胞密度或其他容易观察到的特征可以进行酶分析或菌株筛选时，可以使用各种技术如荧光激活细胞分选(fluorescence activated cell sorting ,FACS)、比色分析、分光光度计或微流体分选装置容易地获得所需的突变体。然而，这种易于筛选的特性对于许多工程酶和菌株来说无法使用。在这种情况下，进化工程中的一个重要瓶颈是缺乏合适的筛选方法来从一群菌株或酶中选择改良的变体。因此，具有所需特性的酶或菌株的选择通常受限于缓慢和低通量技术的使用，例如液相色谱、气相色谱或质谱[83]。

能够监测细胞代谢的生物传感器有望应用于高通量筛选。胞内生物传感器与代谢物相互作用产生可读的输出，可与高通量筛选装置结合，以快速筛选高产菌株[84]。最常见的是生物传感器与流式细胞仪(FACS)，通过荧光的强弱来高效快速地筛选突变株，目前已经开发了各种类型的基于转录因子的生物传感器，能够筛选代谢物，包括内酰胺[69]、丙二酰辅酶A[20]、木糖[70]和NADPH[54]等；而核糖体开关生物传感器已在微生物细胞工厂中应用于乙酰神经氨酸[72]和新霉素[73]等的筛选。除了常用的FACS之外，近期Liu 等[74]利用RNA 具有折叠成复杂结构的灵活性，构建了基于色氨酸特异性适体的生物传感器，结合荧光激活液滴分选系统，建立了色氨酸高产菌株的高通量筛选平台,最终成功筛选到色氨酸产量比原始菌株高165.9%的突变株。生物传感器也可与抗生素抗性基因偶联起到筛选优良菌株的功能，有国外学者利用早先开发的3-羟基丙酸转录因子结合四环素抗性对菌株进行基于抗性压力的定向进化，驯化出的菌株3-羟基丙酸产量达到7.7 g/L[71]；亦有国外学者在酿酒酵母中将自切割核酶glmS整合到胞嘧啶脱氨酶FCY1的3′-非翻译区，以构建用于进化工程的自杀核糖体开关生物传感器，添加氟胞嘧啶阻碍了含有自杀核糖开关的菌株的生长，但随着细胞内N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)水平的增加而恢复生长，从而筛选出高产菌株[75]。

将胞内生物传感器应用到高通量筛选时，有很多关键因素需要考虑，包括检测通量的大小[85]、传感器的特性、筛选设备的要求、通过筛选获得假阳性的风险以及传感器的输入和输出的动态变化，在构建应用于高通量筛选的胞内生物传感器时，应权衡分析所有的关键因素。

3.2 胞内生物传感器“动态”调控代谢平衡

在工程设计微生物细胞工厂的过程中，常遇到的一类棘手的问题就是由代谢失衡引起的干扰，目前的一种解决方法是利用生物传感器进行动态调控，生物传感器根据细胞内化学信号或细胞外环境状态自主控制代谢流量，以避免代谢不均衡或减少有毒代谢物的数量[86-87]，使代谢流向更有力的方向，提高目标化合物的产量。

3.2.1 细胞工厂产物合成与细胞生长解耦 在微生物细胞工厂中，一些生物合成途径与细胞生长竞争。传统上，可以通过阻断竞争途径来解决，但它可能会妨碍细胞的生存能力，从而降低生产率[88]。

另一种有效的解决方法是利用生物传感器的自主动态调控，解耦细胞生长和生产以避免化合物合成和细胞生长之间竞争[89][图6(a)]。应用对葡萄糖浓度作出反应的“营养”传感器延迟了香草酸的合成，从而使大肠杆菌中的细胞生长和生产解耦。代谢压力测试显示，这种营养传感模块的引入将代谢负担降低至原来的1/2.4，并在生物转化为香草酸的过程中实现了强劲的增长率[76]；将肌醇(myoinositol,MI)生物传感器和群体感应(quorum sensing,QS)系统相结合，这种分层动态途径控制策略被用于D-葡萄糖二酸的生物合成。这一策略同时平衡了关键中间体肌醇的生产和消耗速率以及解耦的细胞生长和D-葡萄糖二酸的生产，以避免与必需的糖酵解竞争，使D-葡萄糖二酸最终浓度增加了五倍，达到2 g/L[21]；通过将植物激素细胞分裂素系统与酵母内源Ypd1-Skn7 信号转导途径相整合而开发出群体感应，在酿酒酵母中构建了一个生长素诱导的蛋白质降解系统，并使用群体感应来调节生长素合成以实现蛋白质降解的动态控制，将这一策略应用到α-法尼烯的生产中，使其效价提高了80%[77]；将群体感应生物传感器应用到酪醇生产菌株和红景天苷生产菌株的共培养中，理论建模分析与具体实验研究并重，不仅能自动实现细胞生长竞争调节，使菌株生长平衡，还提高了代谢产物酪醇和红景天苷的产量[78]。虽然胞内生物传感器将产物合成和细胞生长分开这个策略可以在适当的时间开启或关闭基因表达，不需要借助外界信号就可以实现自身代谢途径的控制，但系统中的一些问题仍需要考虑，例如基因一旦开启表达是不可逆的，并且为了保证胞内生物传感器的真实可用性还需要对传感器内关键元件的结合位点进行大量筛选和匹配，或者插入几个基因表达盒来制造恰当的时滞以实现生物合成途径的适时开启。

3.2.2 细胞工厂产物合成与细胞生长耦合 一般有效的高产量生产通常会引入代谢负担，该负担会选择大型发酵中非生产性细胞亚群。这种情况下应用的另一种调节代谢平衡的策略是将目标化合物的生产与细胞生长相结合，而不是将细胞生长与生产解耦。通过操纵和重头设计微生物代谢，使得代谢物的合成成为细胞生长所必需的，从而实现生长驱动的表型，还增加了细胞的鲁棒性[90]。然而，建立生长驱动的表型通常需要有一种或多种细胞生长必需的成分从该途径产生，这限制了该方法的普遍性。一种更普遍的方法是“产物成瘾”策略，利用胞内生物传感器将产物合成与细胞生长耦合，如图6(b)所示，细胞工厂的产物被生物传感器特异性响应，传感器中的报告基因由细胞生长必需基因替代，只有不停地合成该产物，生长必需基因才能持续发挥作用，细胞才能得以存活。有国外学者在大肠杆菌中通过仔细地将必需基因folP 和glmM 置于只对甲羟戊酸有反应的生物传感器的控制之下，甲羟戊酸存在的信号与无条件必需基因的表达相联系，使大肠杆菌细胞沉迷于甲羟戊酸的生物合成工程中，并使一个稳定的甲羟戊酸高产菌株能够保持超过95 代的性能[79]。胞内生物传感器使产物合成与生长耦合这一策略还可以关注单个细胞之间的差异，如国内学者开发了一种生长耦合柚皮素-香豆酸-丙二酰辅酶A 平衡的动态调控网络(dynamic regulation network,DRN)，一方面利用已报道的柚皮素（基于转录因子FdeR）生物传感器，通过偶联细胞生长动态放大向柚皮素合成的代谢通量，另一方面引入香豆酸（基于PadR）生物传感器来动态响应香豆酸，这个模块用于增强丙二酰辅酶A的合成，并抑制乙酰辅酶A 流向TCA 循环，这种多层次的DRN 可以根据单个细胞的细胞谱动态调节代谢通量，最终菌株发酵优化后柚皮素产量提高8.7 倍，菌株生长改善20%[80]。

图6 生物传感“动态”调控代谢平衡示意图Fig.6 Schematic diagram of biosensing“dynamic”regulation of metabolic balance

到目前为止，在产物合成与细胞生长耦合这一策略中利用胞内生物传感器构建的动态调控系统还需解决两个问题，一是响应时间的优化，在设计动态调控系统时，胞内生物传感器的响应需要足够灵敏，才能实现对代谢通路的有效调控，缩短发酵时间；其次是稳定性的优化，在实际应用中，调控系统必须足够稳定，才可以实现连续标准化的操作。

4 胞内生物传感器设计面临的挑战

设计细胞内生物传感器不仅需要对基因修饰进行长时间的试错迭代，还需要对修饰的微生物宿主进行表征[91]。尽管生物传感器的构建和评估已有显著进展，但是在设计胞内生物传感器方面仍然存在一系列的挑战。

基于转录因子构建的胞内生物传感器在高通量筛选和动态调控代谢平衡中被广泛使用[92]。但其中主要存在两个问题，一是天然的转录因子的配体特异性较低，构建出的生物传感器灵敏度低，响应动态范围窄，这需要利用蛋白质工程来拓宽或者改变配体特异性[93]；二是不可预测的动态范围，而生物传感器系统里的基因要表达必须有适当的翻译强度，这是由核糖体结合位点(RBS)控制的，所以可以设计一个基于跨RBS(cRBS)大型数据集深度学习的平台，来预测调整生物传感器的动态范围[94]。当在微生物中设计“核糖体开关”生物传感器时，尽管具有高度的配体特异性可以使转录后调节以更简单的方式驱动，但由于对核糖体开关结构切换机制的理解有限，其合理设计仍处于发展阶段[95-96]，至今还有一些难解决的问题，例如关键RNA 元件数量有限、生物传感器的功能通常受限于动态响应和操作范围等，这需要新的策略来支持核糖体开关的构建，可以将高通量测序和计算机深度学习相结合，搭建一个评估序列-结构-功能的平台，从而获得大量的数据，便于分析RNA 序列和功能之间的关系，以提高构建有功能的核糖体开关生物传感器的能力[97]。而基于蛋白质构象变化的胞内生物传感器通常是基于天然蛋白质设计的，面临着蛋白质数量有限的窘境，目前常见的解决方法是利用专业软件及计算机学习来重头设计，不过这仍具有挑战性[98-99]。从关键元件的挖掘到胞内生物传感器的构建，整个过程和计算机的深度学习相结合是一种趋势，利用前沿学科交叉的策略来解决问题更加有效。

除此之外，胞内生物传感器在不同微生物细胞工厂中由于过程和条件的不同，其工作效率也不尽相同。以响应丙二酰辅酶A 的胞内生物传感器为例，同样是利用转录因子FapR 构建生物传感器，但因为是大肠杆菌和酿酒酵母这两种不同的宿主细胞，胞内与转录因子结合的启动子不同，培养两种宿主细胞的条件也相应变化，导致生物传感器的工作效率有所不同，其最终的动态响应范围亦不同[100-102]。所以一个有效的胞内生物传感器需要结合具体的生化过程进行设计，首先要考虑生物传感器的设计目的，是为高通量筛选还是为动态调控，要根据不同的目的有侧重性地设计和优化胞内生物传感器；其次要考虑微生物细胞宿主的种类，其会决定传感器的转化或转染的容易程度及传感器在其中的复制和维护；最后为了获得高检测限和宽动态响应范围，需要传感模块与报告模块表达的适当平衡，即要考虑到传感器两个模块的质粒拷贝数、传感器关键元件的数量和结合位点的相对强度等因素。

5 结论与展望

在过去的十几年中，用于化合物合成的胞内生物传感器的设计和应用取得了重大进展。这些生物传感器成为筛选酶和代谢物的有利工具，可以加快工程化设计微生物的进程。不过胞内生物传感器的设计和应用依旧存在一些挑战，要持续不断地努力来改进和提高生物传感器的设计方法，构建具有所需功能（动态范围、灵敏度和底物特异性）的生物传感器，其中为了匹配相邻模块的输出和输入，良好控制胞内生物传感器的动态范围变得尤为重要，这可以通过蛋白质工程等方法开发更标准化的传感器元件来实现，从而促进生物传感器的发展。展望未来，预计在微生物细胞工厂设计中会越来越多地采用胞内生物传感器来优化菌株开发和合成途径的动态调节，胞内生物传感器将为提高微生物细胞工厂代谢精细调控和目标化合物合成能力发挥重要的作用。