宋 莹 吴可心 邵文达 刘昱利 刘 佳 刘 洋 唐中华*

（1. 东北林业大学化学化工与资源利用学院，哈尔滨 150040；2. 东北林业大学林学院，哈尔滨 150040；3. 中国科学院东北地理与农业生态研究所，哈尔滨 150040）

刺 五 加（（Rupr. Max‐im.）Harms，）、短梗五加（（Rupr. et Maxim.）Seem，）均为五加科（Araliaceae）五加属（）植物，是东北地区五加科仅有的两种同属药用植物，均属落叶灌木植物，常丛生或散生于针阔叶混交林或阔叶林中。刺五加在中国作为中药材广泛应用已有悠久的历史，其根和根茎可入药为五加皮，并被记入中华人民共和国药典，具有保护中枢神经系统和心脑血管系统、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、增强机体免疫力等作用。据现代药理学研究表明，短梗五加在药理方面也有相似作用。

目前，刺五加野生资源匮乏，但对其需求却日益增大。为了保护刺五加野生资源，满足市场需求，中国、韩国、日本等国家自90 年代初就进行了刺五加人工栽培技术的研究，但至今人工栽培体系仍不完善，因此要采取更合理精准的栽培方法，并寻找新的替代品。有研究表明在短梗五加的根、茎、叶中检测到多种药用成分，且与刺五加相比，短梗五加的根和枝中一些成分含量要高于刺五加，如芦丁、山奈酚等。通过毒性实验，发现这些代谢物无细胞毒性，因此短梗五加的根皮可入药，叶片也具有食用价值。深入研究刺五加和短梗五加的药用成分具有重要的应用前景。目前对刺五加和短梗五加的药用成分研究较多，但对刺五加和短梗五加的不同发育时期的初生代谢物差异研究较少。

植物代谢组学技术有全面的定性或定量研究植物内源代谢物质的特点，通过对植物体内大分子代谢产物进行鉴定，解析植物生命周期的代谢途径，进而揭示植物生命活动的奥秘。植物初级代谢是通过合成代谢和分解代谢生成维持生命活动的能量和物质的过程。利用植物代谢组学技术对两种植物的初级代谢产物进行研究，为两种植物的生产应用提供更多可能性。我们先前的研究结果发现，刺五加和短梗五加的药用活性成分在不同组织部位的积累水平不同，其采收最佳年限为3～5 年，在达到最佳年限后，采收时期也尤为重要，在最佳采收时期收获能有效提高刺五加和短梗五加产品的质量和利用率。但目前还鲜见对刺五加和短梗五加叶片中的初级代谢物随季节动态变化积累的相关研究。

在对刺五加和短梗五加长期跟踪和调查中发现，刺五加和短梗五加自5 月上旬萌芽，7 月上旬进入生长生殖阶段，且叶片数目不再增加。本研究通过对不同时期刺五加和短梗五加叶片中的初级代谢产物的检测和3 个时期差异代谢物的筛选，确定叶片不同时期化学成分的积累模式，为提高刺五加和短梗五加叶片利用率、叶片药用采收和食用采摘提供理论基础和依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所用实验材料均来自于东北林业大学化学化工与资源利用学院温室内栽培的3 年生刺五加和短梗五加（经东北林业大学穆立蔷教授鉴定）。2019 年5～10 月的每月中旬采集刺五加和短梗五加距植株顶端20 cm 处的各1 对叶片，每种植物采集3个生物学重复，样品冲洗干净后经液氮速冻并放入-80 ℃冰箱备用。

1.2 样品制备

1.2.1 待测样品制备

分别称取刺五加和短梗五加叶片样品90 mg，放入2 mL 的离心管中，加入540 µL 的冷甲醇和60µL的内标（L-2-氯-苯丙氨酸，0.3 mg·mL，质谱级甲醇配制），放入高通量组织研磨仪（Xinyi-24，宁波新艺超声设备有限公司）中60 Hz 研磨2 min后取出，继续超声提取30 min，加入300 µL 的氯仿，涡旋（20 Hz）2 min，加入600 µL 的去离子水后再次涡旋2 min，超声提取30 min，4 ℃条件下14 000 r·min离心10 min。取700µL 上清液装入玻璃衍生瓶中，用真空离心浓缩仪（LSE-3K，常州金坛良友仪器有限公司）挥干，加入400µL的甲氧胺盐酸吡啶溶液（15 mg·mL）并涡旋震荡2 min后，于震荡培养箱中37 ℃肟化反应90 min，取出后再加入400µL的BSTFA（含1%TMCS）衍生试剂和60µL的正己烷，涡旋震荡2 min，于70 ℃条件下反应60 min。反应完毕后取出样品，室温放置30 min后进行GC-MS代谢组学分析。

1.2.2 GC-MS分析条件及数据处理

使用7890A-5975C 气相色谱质谱联用仪（Agi‐lent，USA）作为本实验的分析仪器，1µL 衍生化后的叶片提取物用无分流模式注入仪器系统，样品经过非极性的DB-SMS 毛细管柱（30 m × 250µm I.D.，J&W Scientific，Folsom，CA）经过分离后进入质谱。载气为高纯氦气（流速1.0 mL·min）。始GC温度为60 ℃，随后柱箱温度以8 ℃/min 的升至125 ℃，以4 ℃/min 升至210 ℃，以5 ℃/min 升至270 ℃，以10 ℃/min升至305 ℃，保持3分钟。电子轰击（EI）离子源保持在260 ℃，电压：-70 V，质量范围为50～600 m·z，在MS 设置下数据采集率为20光谱/秒。

1.3 数据分析

使用数据分析软件（Agilent GC-MS 5975）处理，并采用XCMS 软件包下进行数据的特征峰提取和预处理，将预处理完毕的数据矩阵归一化后导入SIMCA-P（version 13，Umet-rics，Umea，瑞典）软件进行PCA 分析和OPLS-DA 等多元统计分析。再依据变量对分组贡献得分（VIP 得分）大于1 和组间变化的差异检验（-test）显著性（<0.05）为标准，筛选差异代谢物，并将其输入到kegg数据库和Metabo Analyst（https：//www.metaboanalyst.ca/）数据库进行代谢途径的富集和筛选。

使用SPSS 25.0 软件进行统计分析及归一化处理。采用单因素方差分析（one-way ANOVA)，差异显著性<0.05，确定各时期的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 刺五加和短梗五加叶片PCA 和OPLS-DA模型的分析

对GC-MS 原始数据进行预处理后，在刺五加和短梗五加植物样品中共扫描到134个色谱峰，根据色谱峰的保留时间等信息在NIST 数据库和Wiley Registry 代谢组数据库对检测到的色谱峰定性注释，在刺五加和短梗五加中都定性出了大量代谢产物。

为了分析刺五加和短梗五加两物种叶片初级代谢产物在5～10 月的差异性，分别对代谢产物进行最小二乘法和主成分分析，得到了2 个PCA 模型，累积刺五加=0.399，=0.244，短梗五加=0.413，=0.322。从图1中可以看出所有样品均处在置信区间内，但PCA效果不明显。2个品种进行OPLS-DA 分析后，分别得到2 个主成分，刺五加=0.271，=0.265，=0.386，短 梗 五 加=0.202，=0.195，=0.322，3 个参数值相接近，OPLS-DA 模型可信度较PCA 模型更高（见图2）。可以看出2 个品种检测到的化合物分别在5～6 月份聚集，7～8 月份聚集，9～10 月份聚集，因此将5～10 这6 个月份分为3 个时期，即5～6 月份的叶片开始伸展生长时期（生长期Growth period，G），7～8 月份叶片开始积累和转化有用成分时期（旺盛期Ex‐uberant period，E），9～10 月份叶片开始枯黄脱落时期（凋落期Autumn period，A）。

图1 刺五加、短梗五加叶片PCA得分图A.刺五加；B.短梗五加Fig.1 PCA score of A.senticosus and A.sessiliflorusA.A.senticosus；B.A.sessiliflorus

图2 刺五加、短梗五加叶片OPLS-DA得分图A.刺五加；B.短梗五加；1.5月；2.6月；3.7月；4.8月；5.9月；6.10月Fig.2 OPLS-DA score of A.senticosus and A.sessiliflorusA.A.senticosus；B.A.sessiliflorus；1.In May；2.In June；3.In July；4.In August；5.In September；6.October

2.2 刺五加和短梗五加叶片样品差异代谢物的筛选

进一步利用OPLS-DA 模型的VIP 值（VIP>1）和检验（-test）的值（阈值<0.05）来筛选刺五加和短梗五加在3 个发育时期的差异化合物。如表1 所示，在刺五加中筛选出42 个差异化合物，其中糖类化合物8 种，氨基酸类化合物5 种，有机酸类化合物10 种，醇类化合物4 种，脂肪酸类化合物2种，其它化合物13 种；在短梗五加中筛选出48 个差异化合物，其中糖类化合物11种，氨基酸类化合物6 种，有机酸类化合物8 种，醇类化合物4 种，脂肪酸类1种，其它化合物18种。

表1 刺五加和短梗五加叶片3个时期差异化合物定性结果Table 1 Qualitative results of different compounds in leaves of A.senticosus and A.sessiliflorus at three stages

续表1 Continued table 1

2.3 刺五加和短梗五加叶片在3个时期的差异化合物聚类分析

对检测出的刺五加和短梗五加的差异化合物进行最小二乘法和聚类分析，累积2 个OPLS-DA模型，刺五加3 个时期间有显著差异（见图3）；短梗五加3个时期也区分开来（见图4）。由图3～4可知刺五加和短梗五加3个时期有显著区分，因此将刺五加和短梗五加3 个时期的差异化合物分别筛选，做聚类分析。图5 可知，刺五加叶片中差异化合物在3个时期有不同积累，在叶片生长期积累的主要化合物是肌醇和甘油，在旺盛期主要积累的是奎宁酸、苯甲酸、塔罗糖、尿素及烷类、酯类物质，在叶片凋落期主要积累的是可溶性糖、多糖、L-苯丙氨酸及一些烷类化合物。而苹果酸、丁二酸、孜然醇、甲酸酯、正丁胺等化合物在叶片生长的旺盛期和凋落期都有积累。由图6可知，短梗五加叶片的差异化合物在3个时期也有明显的积累，更多集中在叶片生长的旺盛期和凋落期，在生长期积累较少。短梗五加在叶片生长期积累了葡萄糖、丁烯二酸和半乳糖肟，在叶片旺盛期主要积累了异喹啉、蔗糖、阿拉伯呋喃糖、苯酚、有机酸、甘油酯、孜然醇及一些烷类化合物，在叶片凋落期积累糖类、氨基丁酸、多胺、间苯二甲酸、三硅氧烷、五硅氧烷及一些酯类和酮、膦类化合物。

图3 刺五加3个时期叶片OPLS-DA得分图Fig.3 OPLS-DA score of A.senticosus in three stages

图4 短梗五加3个时期叶片OPLS-DA得分图Fig.4 OPLS-DA score of A.senticosus in three stages

图5 刺五加三个时期差异代谢物聚类分析G.生长期；E.旺盛期；A.凋落期；下同Fig.5 Cluster analysis of different metabolites of A.senticosus in three periodsG.Growth period；E.Exuberant period；A.Autumn period；The same as below

图6 短梗五加三个时期差异代谢物聚类分析Fig.6 Cluster analysis of different metabolites of A.sessiliflorus in three periods

对刺五加和短梗五加3 个时期主要代表的差异化合物的相对含量进行方差分析，结果如表2～3所示。在刺五加中糖类在叶片生长期和凋落期积累较多，而氨基酸类物质在叶片旺盛期和凋落期积累较多，甘油、醇类物质在叶片生长期开始积累。在短梗五加中，葡萄糖在叶片生长期积累，阿拉伯呋喃糖和尿素在叶片生旺盛期积累最多，果糖、龙胆糖和甘露糖在叶片凋落期积累最多，蔗糖在3个时期均有积累，而苯酚在叶片旺盛期积累。

表2 刺五加叶片3个时期主要代谢物峰面积差异方差分析Table 2 Variance analysis of peak area difference of main metabolites in leaves of A. senticosus at three stages

3 讨论

表3 短梗五加叶片3个时期主要代谢物峰面积差异方差分析Table 3 Variance analysis of peak area difference of main metabolites in leaves of A. sessiliflorus at three stages

刺五加和短梗五加研究较多的是根、根皮、茎皮中的药用活性成分，但对食用价值方面的报道很少。本研究采用GC-MS 对刺五加和短梗五加5～10 月份叶片中的化合物进行检测，筛选主要的差异代谢物，揭示刺五加和短梗五加叶片生长过程中的初级代谢机制。刺五加中筛选出53个差异化合物，经过PCA、OPLS-DA、聚类等分析发现，刺五加叶片生长期主要积累甘油、肌醇类化合物。甘油酯类化合物是植物细胞组织和器官保护膜的主要组成部分，是发育、转导信号和抵抗逆境的重要因子。甘油酯也能为植物萌发和代谢提供能量，刺五加叶片的生长期需要大量的能量供应，所以甘油类物质积累较多。在叶片生长旺盛期奎宁酸、苯甲酸、塔罗糖及酸类酯类等物质积累。刺五加叶片中奎宁酸在生长期开始积累，到旺盛期达到最多，而后凋落期分解，奎宁酸是一些高等植物特有的有机酸，作为合成芳香族氨基酸的前体物质，在叶片凋落期调控基因表达的蛋白质大量合成，旺盛期积累的奎宁酸被消耗，所以含量减少。苯甲酸类化合物容易被植物吸收，且能够促进细胞分裂和分化，延缓植物体内的蛋白质分解，所在叶片生长旺盛期积累了大量苯甲酸，促进叶片的生长发育。在叶片凋落期糖类、苹果酸和醇类有较多积累。糖类化合物不仅为植物生命活动提供能量，而且作为信号转导因子在植物整个生命周期内发挥重要作用。苹果酸和苯甲酸也是常见的有机酸，在植物根、茎、叶中分布广泛，有机酸参与植物光合和呼吸过程，合成酯类等物质，增强植物抗逆性，因此在凋落期检测到较多有机酸，是植物自身抵抗逆境的表现。

短梗五加差异代谢物在叶片中的积累时期多数同刺五加类似，不同的是短梗五加叶片在生长期葡萄糖积累增多；在叶片生长旺盛期异喹啉、二糖、苯酚、有机酸、甘油酯等化合物积累增多。其中异喹啉是生物碱类化合物的重要组成部分，其本身有镇痛作用，合成的生物碱应用于抗癌及治疗心脑血管等疾病，目前在医学领域中有广泛应用。研究中发现，蔗糖等二糖在叶片生长期积累较少，在叶片旺盛期积累最多，在凋落期开始下降，这一结果与李永庚等研究冬小麦蔗糖淀粉的结果一致，在生长发芽期蔗糖开始积累，在植物开花时期积累最多，随着果实成熟，植株衰败，蔗糖随之减少。在短梗五加叶片的凋落阶段，正丁胺、尸胺等多胺类物质也积累较多。多胺是某些动、植物的生长因子，但在受精和萌发过程中多胺会产生抑制作用，因此多胺类物质的作用有待进一步验证。

4 结论

基于GC-MS 代谢组学技术，对刺五加和短梗五加5～10 月份叶片初级代谢产物进行了对比分析，结果显示，刺五加积累的化合物主要是果糖、苯甲酸等，短梗五加积累的主要是葡萄糖、甘露糖、尿素等。刺五加叶片在叶片旺盛期和凋落期差异化合物积累最多，主要是糖类、有机酸；短梗五加叶片同样是在叶片旺盛期和凋落期积累化合物最多，但主要是糖类、有机酸、脂肪酸、多胺类化合物。综上所述，基于GC-MS技术、结合多元化的统计分析方法，对检测刺五加和短梗五加叶片初级代谢产物季节动态具有一定可行性，可以为刺五加、短梗五加不同时期叶片采摘及药用、食用提供一定的理论基础。