王梦姣 曹钰雪 徐永盛 丁风鹅 苏 乔

（大连理工大学生物工程学院，植物基因工程实验室，大连 116023）

干旱和低温是影响农作物产量的两大主要因素。干旱会导致植物的膜系结构破坏、细胞代谢紊乱及光合速率下降等，从而导致作物生长缓慢，严重时会导致减产甚至绝产。温度是影响植物生长和发育的重要因素，低温会导致植物受到严重损伤甚至死亡。采用基因工程技术将相关抗逆基因转入农作物，进而培育出转基因作物抗逆新品种，是解决干旱和低温灾害的有效途径之一。

冷激蛋白（CSPs）是一类高度保守的核酸结合蛋白，在微生物、动物与植物中广泛存在。CSPs的大部分功能是通过冷休克结构域（CSD）与核酸结合实现的，主要功能是作为RNA 分子伴侣与mRNA 结合，起到稳定mRNA 的作用。CSD 是一个保守的核酸结合结构域，能特异性结合RNA、单链DNA 及双链DNA，阻止mRNA 在逆境胁迫下形成的稳定的二级结构，保证转录和翻译的顺利进行。目前对CSP的研究已经有了较大进展，已从多种生物中克隆出。最早被发现和研究的冷激蛋白是大肠杆菌（）的CspA。已陆续从嗜热链球菌（）、沙门氏杆菌（serovar Ty‐phimurium）等微生物，小麦（L.）、拟南芥（）、水稻（L.）等植物中克隆出。

一些研究已证实了CSP 基因的转入能提高农作物的抗逆性。Castiglioni 等将大肠杆菌的CspA 和枯草杆菌的CspB转入了拟南芥、水稻和玉米（Zea mays）中，在干旱胁迫条件下，转基因植株的叶片生长、叶绿素含量和光合速率显著优于野生型。对转CspB 基因的玉米进行田间干旱试验，转基因玉米的单穗籽粒数量显著高于野生型玉米。徐萍莉等将枯草芽孢杆菌（）XS-01 的cspB 基因转入烟草（），干旱胁迫结果表明在土壤水分恢复10 d 后，转基因植株的单株干质量较野生型显著增加；转基因植株的光合速率能快速恢复，但野生型植株恢复缓慢。Yu 等研究表明在干旱和盐胁迫条件下，转SeCspA 和SeCspB 基因小麦比野生型具有更低的丙二醛含量、失水率和钠离子含量，更高的叶绿素含量和脯氨酸含量；田间试验表明，在干旱胁迫条件下，与野生型相比，转SeCspA 基因小麦品系的千粒质量和产量均有较大提高。孙雪慧等将来源于枯草芽孢杆菌的基因cspB 转入大豆（Gly‐cine max）中，研究表明在自然干旱25 d 后非转基因植株已近萎蔫，而转cspB 基因大豆长势相对较好。Choi 等将白菜（Brassica pekinensis）中的冷激蛋白基因BrCSDP3 转入到拟南芥中，发现在脱落酸（Abscisic Acid，ABA）、干旱和盐碱胁迫状态下，转基因拟南芥发芽率更高、根长增加和幼苗生长状态更好。王红蕾等研究表明在低温（4 ℃）胁迫下，转AmCSDP 基因烟草萌发率、存活率和长势均显著高于野生型。

海洋面积占地球总面积的70%，且海洋环境中的微生物约有100 万种。99%的海洋微生物不能用传统方式进行分离培养，使得对其功能的使用受到了限制，其中很可能存在人们从未研究过的CSP 家族蛋白。近年来提出的宏基因组学（Metagenomic）技术克服了“培养限制”的问题。该技术直接将特定小生境中全部微小生物的遗传物质进行整体提取并对微生物群体进行研究分析，使得人们对海洋微生物有了进一步认识，能更大限度的利用海洋微生物资源。目前多数冷激蛋白基因是从已知生物中得到，来源于未知海洋微生物的鲜见报道。

因此，本研究拟从海洋微生物宏基因组DNA中克隆基因，将其构建植物表达载体pTF101-并采用花序浸染法转化拟南芥，通过干旱和低温胁迫条件下对植株进行生物量的测量和生理指标的检测，来研究该基因的抗旱和耐寒功能，为培育农作物抗逆新品种奠定基础。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

海洋微生物来源于中国大连黑石礁海域（38.9°N，121.6°E）。野生型拟南芥（）、植物表达载体pTF101、根癌农杆菌（）GV3101 菌株和大肠杆菌（）DH5α菌株均为本实验室保存样本。

1.2 海洋微生物MbCSP基因编码区的克隆

采用Francis 等在CSP 家族基因序列高度保守区设计的一对简并引物CSPU5 和CSPU3（见表1），以海洋微生物宏基因组DNA为模板，PCR 扩增基因部分编码区。采用宝生物公司的MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0 DNA 回收试剂盒回收PCR 产物，连接到pMD18-T载体上，并转入大肠杆菌DH5α，提取质粒，PCR 检测后选取阳性克隆进行测序。

表1 PCR 引物序列Table 1 PCR primer sequence

3′DNA 和5′DNA 序 列 采 用 锚 定PCR方法获得。根据已克隆得到的基因保守区序列设计两条特异性巢式引物CSP-1 和CSP-2（见表1）。以海洋微生物宏基因组DNA 为模板，首先采用特异性引物CSP-1 和CSP-2 分别进行单引物扩增，在末端转移酶（TdT）的作用下，在单链扩增产物的3′末端和5′末端分别加上寡聚鸟嘌呤oligo d（G）；以加尾产物为模板，分别采用特异性巢氏引物CSP-3和CSP-4与Oligo d（C）进行PCR扩增；电泳分离后切取目标条带回收，回收片段连接到pMD18-T 载体上，并转入大肠杆菌DH5α，提取质粒，PCR检测后选取阳性克隆进行测序。

将上述克隆得到的基因保守区、3′端和5′端片段进行拼接，获得完整的DNA 序列。通过NCBI（ORF Finder）分析，获得基因ORF全长序列。设计ORF 全长引物（CSP-S/CSP-A）（见表1），以海洋微生物宏基因组DNA 为模板，PCR获得该基因ORF 序列，回收PCR 产物，连接到pMD18-T 载体上，并转入大肠杆菌DH5α，提取质粒，PCR检测后选取阳性克隆进行测序。

1.3 MbCSP基因编码区的生物信息学分析

根据基因的开放阅读框，采用Gene Tool 软件，推测其氨基酸序列。采用在线软件ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）进 行蛋白理化性质预测分析。采用NCBI Blastp查找与MbCSP 同源性较高的氨基酸序列。采用ClustalW与其它来源的CSP 家族基因进行氨基酸序列同源性比对分析。采用MEGA 6.0 软件运用Neighbor-Joining算法构建系统发育树。

1.4 花序浸染法转化拟南芥

1.4.1 表达载体的构建和转基因拟南芥的获得

提取pMD18T-质粒和双元表达载体pTF101质粒，分别用Ⅰ和Ⅰ对其进行双酶切并回收，采用T4 连接酶连接pTF101 大片段和，连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，经质粒PCR 和Ⅰ、Ⅰ双酶切检测后筛出阳性克隆，获得植物表达载体pTF101-。采用根癌农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥。

1.4.2 转基因拟南芥的分子检测

将收获的T1代种子均匀地播种于方形盆中，待拟南芥长至两片真叶时喷洒质量浓度为40 mg·L的Basta 溶液，每2～3 d 喷洒1 次，喷洒3～4 次后即可筛选出阳性植株。继续培养至植株长到6 片叶子时，剪取0.1 g 叶片采用植物基因组提取试剂盒（TIANGEN，北京）提取DNA。利用基因上的正向引物CSP-S 以及载体上的反向引物XHNR（见表1）进行PCR 检测进一步确定转基因植株。采用RNAisoPlus 试剂提取玉米叶片总RNA，根据大连宝生物公司PrimerScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒说明书进行反转录反应。以反转录得到的cDNA为模板，以actin-F 和actin-R 为内参基因引物，CSP-S 和CSP-A为目的基因引物（见表1）进行半定量RT-PCR 检测。PCR 反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，28 个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.5 转MbCSP 基因拟南芥在干旱和低温胁迫下的生理检测

将收获的T2 代种子均匀地播种于方形盆中，待拟南芥长至两片真叶时喷洒Basta 溶液，将筛选出的转基因植株移栽到方形盆中，每个方形盆内栽种两棵，待生长5周后用于生理检测。对照野生型拟南芥按照上述相同方式培养，不喷洒Basta 溶液。选取生长状况一致的转基因和野生型拟南芥进行生理检测。第一组拟南芥进行干旱胁迫（前期浇足水，后期不再浇水），第二组拟南芥进行低温（5 ℃）胁迫，两组均在第0、3、6、9 和12 d 取样进行检测。实验设置3 次生物学重复，3 次技术重复，以减小实验误差对结果的影响。

1.5.1 生物量的测量

取实验组和对照组各3株完整的拟南芥，洗净后放入烘箱中105 ℃杀青30 min，然后调至80 ℃烘干至恒质量，记录干质量（g），求出平均值。

1.5.2 叶片相对含水量（RWC）的测定

分别在转基因和野生型拟南芥的相同部位取适量的叶片，并测量其鲜质量（）。将拟南芥叶片浸入蒸馏水中8 h，使组织充分吸水达到饱和。将叶片从蒸馏水中取出，用滤纸迅速吸去叶片表面水分，称取其饱和鲜质量（）。再将叶片放入培养皿中，80 ℃下烘干至恒质量，称取干质量（）。计算相对含水量：

1.5.3 叶绿素含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量的测定

分别在转基因和野生型拟南芥相同部位称取叶片（测定MDA 称取去掉叶脉的叶片）0.2 g，参照《植物生理生化实验原理和技术》中的方法对叶绿素、SOD和MDA含量进行测定。

2 结果

2.1 海洋微生物MbCSP基因编码区的获得

以海洋微生物宏基因组DNA 为模板，利用简并引物CSPU5 和CSPU3，经PCR 获得约200 bp 的部分编码区片段（见图1A），回收纯化目的片段并测序。测序结果通过NCBI数据库做Blastn比对，结果显示：该序列与（）基因序列的同源性为90%，初步推断此DNA 片段是海洋微生物宏基因组冷休克蛋白基因编码区的部分序列。通过3′锚定PCR 方法获得3′端片段（见图1B），回收约850 bp 的条带并测序。通过5′锚定PCR 方法获得5′端片段（见图1C），回收约800 bp的条带并测序。拼接获得的三段序列，通过NCBI ORF Finder 软件得到5 个可能的ORF，通过与已知序列的比对，找到目的编码区，获得基因编码区序列216 bp。设计ORF 全长引物，以海洋微生物宏基因组DNA 为模板进行PCR 扩增，得到216 bp 的片段（见图1D），回收PCR 产物连接T 载后并测序。测序结果表明此全长序列与拼接序列完全相同。

图1 海洋微生物宏基因组MbCSP基因电泳图A.部分编码区PCR 扩增；B.3′锚定PCR；C.5′锚定PCR；D.ORF PCR 扩增；M.DL2000 DNA Marker；1～2.部分编码区PCR 产物；3.3′锚定PCR产物；4.5′锚定PCR产物；5～6.ORF PCR产物Fig.1 Electrophoresis of marine microbial metagenomic MbCSPA.PCR amplification of partial coding region；B.3′anchor PCR；C.5′anchor PCR；D.PCR amplification of ORF；M.DL2000 DNA Marker；1-2.PCR product of partial coding region；3. 3′anchored PCR prod‐uct；4.5′anchored PCR product；5-6.ORF PCR product

2.2 海洋微生物MbCSP基因序列的生物信息学分析

采用Gene Tool 软件推测出MbCSP 氨基酸序列，其编码一个由71 个氨基酸构成的蛋白。采用Prot Param 预测MbCSP 蛋白的基本生理和生化特征，该蛋白的分子式为CHNOS，相对分子量为17.81 kDa，等电点（pI）为5.34。采用NCBIBlastp 查找MbCSP 氨基酸同源序列，采用ClustalW进行多重序列比对，结果发现MbCSP 蛋白包含RNP1（KGFGFI）和RNP2（VFVHF）等保守结构域（见图2）；该氨基酸序列与EcCSPG、EcCSPA（大肠杆菌），BsCspB（枯草芽孢杆菌）和BcCspA（蜡样芽孢杆菌）等冷休克蛋白氨基酸序列同源性分别为90%、78%、64%、和60%。采用MEGA6.0软件进行系统发育树分析，结果表明其与EcCspG（大肠杆菌）和CmCspG、CmCspB（堆肥宏基因组）等生物的冷休克蛋白亲缘关系较近（见图3）。已将该基因提交至Genbank，基因号为MW202239。

图2 MbCSP蛋白的多重序列比对黑框标示为RNP1和RNP2所在位置Fig.2 Multiple sequence alignment of MbCSP proteinThe black box indicates the location of RNP1 and RNP2

图3 MbCSP蛋白的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of MbCSP protein

2.3 转MbCSP 基因拟南芥的筛选和鉴定

经过花序浸染法转化和Basta筛选获得4株拟南芥转化苗。待植株长至六片叶子时，以叶片DNA 为模板进行PCR 检测，均出现与预期大小相符的目的片段，说明基因已成功整合到拟南芥的基因组中（见图4A）。半定量RT-PCR 分析结果表明，4 个转基因株系中的外源基因在转录水平上均表达，选择表达量最高的L2 株系进行后续生理检测（见图4B）。

图4 转MbCSP基因拟南芥的分子检测A.PCR 检测；B.半定量RT-PCR 检测；M.DL2000 Marker；1.ddH2O；2.野生型；3～6，L1～L4.转基因植株Fig.4 Molecular detection of transgenic Arabidopsis plants containing MbCSPA.PCR detection；B.Semi-quantitative RT-PCR detection；M.DL2000 Marker；1.ddH2O；2.Wild-type；3-6，L1-L4.Transgenic plants

2.4 过表达提高转MbCSP基因拟南芥的抗旱性

选用生长状态一致的野生型和转基因拟南芥进行干旱胁迫。结果表明：干旱处理前野生型和转基因拟南芥生长状态正常，叶片饱满且舒展（见图5A）；干旱处理12 d 后，野生型拟南芥叶片出现明显的萎蔫、干枯、颜色变深和茎无法直立，而转基因拟南芥叶片虽有失水现象，叶片颜色变深，但叶片仍能保持舒展（见图5B）。干旱处理12 d 后，野生型和转基因拟南芥的干质量分别为23.2±10.3 和32.4±6.7 mg，转基因拟南芥比野生型植株的干质量高出39.66%。

图5 干旱胁迫处理前和12 d后野生型以及转MbCSP基因拟南芥的表型A.干旱处理前；B.干旱处理12 d后Fig.5 Phenotypes of wild-type and transgenic Arabidopsis plant containing MbCSP before and after12 d drought stress treatmentA.Before drought stress treatment；B.After 12 d drought stress treatment

在正常生长条件下，野生型拟南芥与转基因拟南芥的叶片相对含水量差异不显著，分别为87.47%和83.03%；经过12 d的干旱胁迫，野生型拟南芥的叶片相对含水量骤降至27.65%，而转基因拟南芥的叶片相对含水量是野生型的2.62倍（见图6A）。

干旱胁迫前，转基因拟南芥与野生型拟南芥叶片中的叶绿素含量差异不显著；在干旱处理第3、6、9 和12 d，转基因拟南芥中叶绿素含量均显著高于野生型，分别是野生型的1.20、1.12、1.31 和1.30 倍（见图6B）。在正常生长条件下，野生型和转基因拟南芥叶片中的MDA 含量均较低，且二者无显著差异；干旱9 d 后，野生型拟南芥中MDA 含量急速上升。干旱12 d 后，转基因拟南芥的MDA含量显著低于野生型（见图6C）。SOD活性随着干旱胁迫的进行呈现先升高后降低的趋势，在干旱第6d 时达到最高，转基因植株的SOD 活性始终高于野生型植株（见图6D）。

图6 干旱胁迫下野生型和转MbCSP基因拟南芥的生理指标“*”代表在P＜0.05时差异显著，下同Fig.6 Physiological indexes of wild-type and transgenic Arabidopsis plant containing MbCSP under drought stress“*”represents a significant difference at the 0.05 level，the same as below

2.5 过表达提高转MbCSP基因拟南芥的耐寒性

低温处理前，转基因和野生型拟南芥生长状况良好且状态基本一致（见图7A）；在经过12 d的低温处理后，野生型拟南芥叶片出现萎蔫，叶片颜色变深，而转基因拟南芥仍能正常生长（见图7B）。低温处理后野生型拟南芥的整株干质量为28.9±8.7 mg，转基因拟南芥的整株干质量为49.3±15.0 mg；转基因拟南芥比野生型拟南芥的生物量高出了70.59%。

图7 低温胁迫处理前和12d后野生型以及转MbCSP基因拟南芥的表型A.干旱处理前；B：干旱处理12 d后Fig.7 Phenotypes of wild-type and transgenic Arabidopsis plant containing MbCSP before and after 12 d low temperature stress teratmentA.Before drought stress treatment；B.After 12 d drought stress treatment

正常生长时，野生型和转基因拟南芥的叶片相对含水量约为88%；低温胁迫12 d 后，转基因和野生型拟南芥的叶片相对含水量都有所下降，最终分别为74%和64%，且二者差异显著（见图8A）。低温胁迫前，转基因与野生型拟南芥叶片中的叶绿素含量没有显著性差异；在低温胁迫过程中，转基因与野生型拟南芥中叶绿素含量均在逐渐下降，在低温胁迫9 d 后，转基因拟南芥的叶绿素含量显著高于野生型（见图8B）。在低温处理前6 d，转基因拟南芥中的MDA 含量无明显变化，而野生型的MDA 含量明显升高。随着低温处理天数的不断增加，拟南芥叶片中的MDA 含量不断上升，低温处理12 d 时，转基因拟南芥中的MDA 含量显著低于野生型（见图8C）。正常生长条件下，野生型和转基因拟南芥中SOD 活性基本一致；随着胁迫时间的延长，转基因和野生型拟南芥中SOD 活性都在上升，低温胁迫12 d 时转基因拟南芥的SOD活性显著高于野生型（见图8D）。

图8 低温胁迫下野生型和转MbCSP基因拟南芥的生理指标Fig.8 Physiological indexes of wild-type and transgenic Arabidopsis containing MbCSP under low temperature stress

3 讨论

干旱和低温严重影响农作物的生长和产量，通过转基因技术提高农作物的抗逆性是解决此问题的主要途径之一。一些研究表明过表达基因可以提高转基因作物的抗旱或耐寒性，但大部分基因是从已知微生物或植物中获得。不同来源的基因功能可能存在差异，而99%的海洋微生物不可培养，因此我们尝试从海洋微生物宏基因组中克隆基因并进行功能分析。

本研究采用锚定PCR 技术从海洋微生物宏基因组DNA 中克隆获得了基因，对其进行了生物信息学分析：MbCSP 蛋白包含RNP1（KGFG‐FI）和RNP2（VFVHF）等CSP 蛋白经典的保守结构域；与已报导的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌的冷休克蛋白氨基酸序列的同源性在60%～90%，表明为冷休克蛋白基因。通过农杆菌介导的花序浸染法将基因转入拟南芥中，分子检测和Basta 筛选结果表明外源基因和标记基因均已成功转入拟南芥中，且在转录水平上可以表达，选择表达量最高的阳性株系进行后续干旱和低温胁迫下的生理检测。

干旱胁迫处理12 d 后进行观察和检测：转基因拟南芥的叶片仍能保持舒展，而野生型拟南芥叶片出现明显的萎蔫、干枯；转基因拟南芥的生物量比野生型植株高出39.66%，叶片相对含水量是野生型的2.62 倍；叶绿素含量显著高于野生型，MDA含量显著低于野生型。上述结果表明过表达基因提高了转基因拟南芥的抗旱能力，这与Castiglioni 等、徐萍莉等、Yu 等和孙雪慧等研究结果一致。低温胁迫处理12 d 后进行观察和检测：转基因拟南芥仍能正常生长，而野生型拟南芥叶片出现萎蔫；转基因拟南芥的生物量比野生型植株高出70.59%；转基因拟南芥的叶片相对含水量、叶绿素含量和SOD 活性均显著高于野生型，MDA 含量显著低于野生型。上述结果表明过表达基因提高了转基因拟南芥的耐寒能力，这与王红蕾等研究结果一致。

综上所述，目前多数研究结果仅表明过表达基因可以提高抗旱或耐寒能力，而本研究从海洋微生物宏基因组DNA 中克隆获得基因并转入拟南芥中，结果表明过表达基因可以同时提高植株的抗旱和耐寒能力，未来可以将该基因转入玉米和大豆等农作物中培育抗逆新品种。