孙铭悦 雷珂 任琳琳 王佳 巩芮宁 田字彬

1青岛大学附属医院消化内科，青岛 266042；2青岛大学附属医院肿瘤免疫及细胞治疗中心，青岛 266042

【提要】 采用RT-PCR法检测RNA结合蛋白核不均一核糖核蛋白(HNRNP)AB的两个剪接体HNRNPAB1和HNRNPAB2在15株恶性肿瘤细胞系、1株正常胰腺导管上皮细胞系、4株胰腺癌细胞系及17例胰腺肿瘤组织中的表达。结果显示胰腺癌细胞系以HNRNPAB2表达为主，而肝癌、结肠癌、胃癌、宫颈癌、视网膜恶性肿瘤、乳腺癌细胞系等肿瘤细胞系以HNRNPAB1表达为主。正常胰腺导管上皮细胞的HNRNPAB1与HNRNPAB2表达量显著低于胰腺癌细胞系。HNRNPAB1与HNRNPAB2的表达量比值与胰腺癌恶性程度呈正相关。

剪接是将内含子从前体mRNA中移除，外显子连接形成成熟mRNA的过程。可变剪切(alternative splicing，AS)又称选择性剪切，在前体mRNA到成熟RNA的过程中，不同的剪切方式使得同一个基因可以产生多个不同的成熟mRNA，最终产生不同的蛋白质。近年来研究[1-2]发现，AS事件在肺癌、膀胱癌和乳腺癌等癌症中广泛存在,且在急性髓系白血病、慢性淋巴细胞白血病和黑色素瘤中高度复发。剪接因子通常以浓度依赖的方式引起选择性剪接的变化，并通过影响多种细胞过程的全基因组剪接改变促进致癌转化。

核不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleo-protein, HNRNPs)是一个庞大的、结构多样的RNA结合蛋白家族，在剪接、mRNA运输和翻译中具有不同的作用[3]。HNRNPAB作为家族成员之一，位于真核细胞的细胞核中，可协助前体mRNA的可变剪接[4]，参与聚腺苷酸化[5]、mRNA稳定性的调控、核-胞质转运和DNA复制与重组[6]，还参与癌症发生发展，促进肿瘤细胞的形成、侵袭、转移，影响预后。HNRNPAB剪切体有两种，两种剪切体协同作用，才能促进中枢神经系统发育过程中神经细胞的正常迁移[7]。有研究报道[8]，AS事件风险值可作为胰腺癌的独立预后因子。本研究检测HNRNPAB两种剪切体在胰腺癌细胞系和肿瘤组织中的表达差异，探讨其临床意义，以期能为胰腺癌的诊治提供新的分子标志物和治疗靶点。

一、材料与方法

1．胰腺癌组织及细胞株：收集2019年4月至2020年2月间青岛大学附属医院储存在-80℃冰箱中的RNAlater(美国Sigma公司)中的17例胰腺肿瘤组织及肝转移组织，其中良性肿瘤6例，分别为胰腺神经内分泌瘤2例，胰腺实性假乳头状瘤2例，微囊性腺瘤1、黏液性囊性肿瘤1例。恶性肿瘤11例，均为胰腺导管腺癌，其中6例无淋巴结及远处转移，定义为低度恶性；5例有淋巴结或远处转移，定义为高度恶性。记录患者年龄、性别、肿瘤大小、病理分级、临床分期、是否淋巴结转移及远处转移等。

共选择20株细胞系。人正常胰腺导管上皮细胞系HPDE6-C7及胰腺癌细胞系ASPC1、BXPC-3、PANC1、MIA PaCa-2均购自武汉普诺赛生命科技有限公司；肝癌细胞系HccL-M3、HepG2、Hep3β、HuH7、PLC，结肠癌细胞系HT-29、SW480，胃癌细胞系AGS、BCG832，宫颈癌细胞系Hela、Siha、C33A，视网膜母细胞瘤细胞系Y79、OCM-1，乳腺癌细胞系HCC1937均为青岛大学附属医院医学研究中心惠赠。所有细胞株均常规复苏、培养、传代。

2．RT-PCR扩增HNRNPAB剪切体：采用Trizol(美国Invitrogen公司)分别抽提20株对数生长期细胞及17例胰腺肿瘤组织总RNA，使用Biospec Nano核酸分析仪(Shimadzu Spectrophotometer)检测样本RNA纯度和浓度。采用PrimeScriptRT reagent Kit gDNA Eraser试剂盒(日本TaKaRa公司)将总RNA逆转录为cDNA，按说明书操作。利用NCBI网站设计能同时扩增HNRNPAB剪切体1和2的特异性引物，正向引物序列为5′-GGCTACGGCAACTACTGGAA-3′，反向引物序列为5′-GCATGTGTGCGATCAGTTGG-3′。引物由北京六合华大基因科技有限公司青岛分公司合成。应用Phanta Master Mix(南京Vazyme公司)行PCR扩增，反应条件：95℃ 3 min，95℃ 10 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，35个循环。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳分离，通过ImageJ图像分析软件行灰度扫描，以条带灰度值代表其表达量。每个样本设3个复孔，取均值。

3．测序：将扩增的PCR产物送北京六合华大基因科技有限公司青岛分公司测序，测序结果与原始序列进行对比，确定PCR扩增片段是否为目标剪切体序列。

二、结果

1．HNRNPAB两种剪切体的测序鉴定：胰腺肿瘤组织及细胞RNA均扩增出2条片段，分子质量分别为352、211 bp，条带大小与预期产物片段大小相一致。分离、纯化凝胶电泳中所见的2条带的PCR产物，测序结果证实其核苷酸序列与NCBI数据库中HNRNPAB基因2种剪切体序列信息完全一致。HNRNPAB1的产物为352 bp，HNRNPAB2的产物为211 bp。

2．各细胞系HNRNPAB两种剪切体的表达：1株人正常胰腺导管上皮细胞系HPDE6-C7、4株胰腺癌细胞系ASPC1、BXPC-3、PANC1、MIA PaCa-2细胞HNRNPAB两种剪切体表达的灰度值及HNRNPAB1/HNRNPAB2灰度值比(AB1/AB2值)见表1。4株胰腺癌细胞系的HNRNPAB1表达量均显著低于HNRNPAB2，均以HNRNPAB2表达为主。HNRNPAB1平均灰度值为6286.06，HNRNPAB2为9446.60，平均AB1/AB2值为0.67，均显著高于HPDE6-C7细胞的1 457±178、2 719±176、0.54，差异有统计学意义(P值均<0.001)，提示胰腺癌细胞株HNRNPAB均高表达，且以HNRNPAB2表达为主。

表1 胰腺细胞株HNRNPAB剪切体灰度值

肝癌、肠癌、胃癌、乳腺癌、宫颈癌、视网膜母细胞瘤共15株细胞系HNRNPAB1的表达量均显著高于HNRNPAB2(表2)，均以HNRNPAB1表达为主，HNRNPAB1平均灰度值为10011.00，HNRNPAB2为5839.37，平均AB1/AB2值为1.79。其他恶性肿瘤细胞株的平均AB1/AB2值显著高于胰腺癌细胞株的平均AB1/AB2值，差异有统计学意义(1.79比0.67，t=6.13，P<0.010)。

表2 15株其他恶性肿瘤细胞系HNRNPAB剪切体灰度值

3．胰腺肿瘤组织HNRNPAB两种剪切体的表达：17例胰腺肿瘤组织HNRNPAB1、HNRNPAB2剪切体电泳图见图1。6例胰腺良性肿瘤均以HNRNPAB2表达为主，HNRNPAB1平均灰度值为2 981，HNRNPAB2为6 137，平均AB1/AB2值为0.35(表3)。6例为低度恶性胰腺癌中，HNRNPAB2的灰度值均显著高于HNRNPAB1，以HNRNPAB2表达为主。HNRNPAB1平均灰度值为2 412，HNRNPAB2为5 575，平均AB1/AB2值为0.41(表4)。5例高度恶性胰腺癌组织中，3例HNRNPAB2的灰度值略高于HNRNPAB1，差异无统计学意义，以HNRNPAB2表达为主；1例导管腺癌伴腹腔转移灶组织及1例神经内分泌癌伴肝转移组织HNRNPAB2灰度值低于HNRNPAB1(P值分别为0.001、0.432，表4)。HNRNPAB1平均灰度值为9 444，HNRNPAB2为9 535，平均AB1/AB2值为1.10。高度恶性肿瘤的AB1/AB2显著高于低度恶性肿瘤及良性肿瘤，差异均有统计学意义(t值分别为3.05、2.95，P值分别为0.013、0.016)，而低度恶性肿瘤与良性肿瘤的差异无统计学意义。

注：1、2、3、5、7、8、9、10、12、13、15为胰腺癌；4、6为胰腺神经内分泌瘤；11为微囊性腺瘤；14、16为胰腺实性假乳头状瘤；17为黏液性囊性瘤图1 17例胰腺肿瘤组织HNRNPAB1、HNRNPAB2剪切体电泳图

表3 6例胰腺良性肿瘤组织HNRNPAB剪切体灰度值

表4 11例胰腺癌组织HNRNPAB剪切体灰度值

4．胰腺癌组织HNRNPAB两种剪切体表达量比值与肿瘤临床病理参数的相关性：以11例胰腺癌组织AB1/AB2中位数为界，将其分为AB1/AB2<0.7组和≥0.7组，结果显示，两组的差异与临床分期显著相关，而与患者年龄、性别、肿瘤病理分级、T分期、淋巴结转移均无相关性(表5)。

表5 胰腺癌组织HNRNPAB两种剪切体灰度值比与肿瘤临床病理参数的相关性

讨论HNRNPAB蛋白结构上含有两个串联的RNA结合域(RNA Binding Domain，RBD)以及保守的N端和C端的结构域，C末端的结构域富含甘氨酸，一般称为辅助结构域，负责与其他HNRNPs相互作用[9-10]。RNA结合的特异性主要是由蛋白质的3D结构介导，RBD周围的结构区域微调RNA与蛋白质的相互作用[11]。HNRNPAB1含有8个外显子，编码322个氨基酸的蛋白质，分子量约为36 000；HNRNPAB2的辅助结构域缺少1个约140 bp外显子，编码285个氨基酸的蛋白质，分子量约为30 000。辅助结构域的不同，可能影响其功能。

文献报道，肝癌[12]、前列腺癌[13]、纤维母细胞瘤[14]组织HNRNPAB总量呈高表达。肝癌组织HNRNPAB可通过上皮间充质转换(epithelial-mesenchymal transition, EMT)促进肿瘤细胞侵袭转移[12]；HNRNPAB可激活与前列腺癌进展相关的细胞周期基因子集，从而促进肿瘤生长和转移[13]；肿瘤纤维母细胞组织HNRNPAB作为一种TGF-β诱导因子可导致肿瘤形成及恶化[14]；乳腺癌HNRNPAB表达参与细胞周期调控，特别是G2/M期的转变影响预后[15]。上述研究表明HNRNPAB在肿瘤的发生中可能是一种促癌因素，但这些研究主要关注的是HNRNPAB的功能，而没有涉及到HNRNPAB两个剪切体。

本研究结果显示，4株胰腺癌细胞株HNRNPAB1及HNRNPAB2表达均显著高于正常胰腺导管上皮细胞系，且以HNRNPAB2表达为主，提示胰腺恶性细胞株HNRNPAB高表达，尤其是HNRNPAB2表达量更高。但其他组织来源的肿瘤细胞系绝大多数HNRNPAB高表达，以HNRNPAB1表达为主。其原因可能是HNRNPAB两种剪切体的主要功能域虽然相同，但辅助结构域不同，后者负责与其他HNRNPs进行相互作用[9-10]，提示HNRNPAB两种剪切体可能与不同HNRNPs结合而发挥不同的功能，形成不同的功能模块及蛋白网络。因此在胰腺组织中的RNA结合蛋白HNRNPAB，可能以HNRNPAB2剪切体的蛋白作用网络为主，通过其mRNA选择性剪切以及蛋白互相作用的功能，在胰腺发育过程中发挥重要作用。

本研究结果还显示，胰腺癌组织HNRNPAB两个剪切体表达量升高，绝大多数以HNRNPAB2表达为主。高度恶性肿瘤的AB1/AB2值显著高于低度恶性肿瘤及良性肿瘤，差异均有统计学意义，而低度恶性肿瘤与良性肿瘤的差异无统计学意义。胰腺癌肝转移组织及腹腔转移灶组织主要表达HNRNPAB1，提示随着胰腺癌恶性程度的增高，HNRNPAB1的表达水平迅速增高，甚至超越HNRNPAB2。有淋巴结转移或远处转移的胰腺癌AB1/AB2≥0.7与肿瘤临床Ⅲ+Ⅳ分期呈正相关也支持HNRNPAB1高表达促进肿瘤的迁移和侵袭这一结论。

本研究尚存在一些缺陷：其一，缺少对其他肿瘤细胞株相应的正常细胞株的检测；其二，没有匹配胰腺癌旁正常胰腺组织检测；其三，病例数少，故需更多的严谨的研究设计和更多的临床样本进行验证。

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