廖文通

（广东轻工职业技术学院，广东广州 510330）

氯霉素为呈白色或微黄色的针状、片状晶体，无臭，味苦，熔点为149～153 ℃；易溶于乙醇、丙酮和乙酸乙酯，微溶于水、乙醚和氯仿，不溶于苯和石油醚。在室温下pH值为2～9的水溶液中，氯霉素能稳定存在24 h以上，蒸馏水煮沸5 h也不会影响它的活性。氯霉素作为一种广谱抗生素，过去在畜牧养殖业中广泛应用，但是它本身的毒副作用较强，残留在动物体内经食物链传给人类，会危害人体健康。《食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单》（农业农村部公告第250号）中明确规定：禁止氯霉素及其盐、酯在所有食品动物中使用；《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》（GB 31650—2019）中规定：氯霉素在所有动物源性食品中不得检出[1]。目前，食品中氯霉素的检测技术方法较多，且人员、环境、技术操作等因素均会影响检测结果，因此检验人员必须加强质量控制。

1 食品中氯霉素的来源和危害

1.1 氯霉素的来源

近年来的监督检查中发现，在部分动物性食品如鸡、鸭、猪、牛和鱼肉中检测出氯霉素。这些氯霉素主要来源于3个方面：①为防止动物生病，促进动物生长，缩短养殖周期，动物养殖过程中在饲料内违规添加氯霉素；②水产品运输过程中保存活力，尤其是海鲜产品长途运输中，在水中加入氯霉素延长海鲜的存活时间，降低死亡率，从而获得更高的经济效益；③饲养过程中的水质出现外源性污染，这种情况比较少见。

1.2 氯霉素的危害

氯霉素本身既是一种抗生素，也是一种杀菌剂，对革兰阳性菌和阴性菌具有较强的抑制作用，对大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌以及肺炎球菌等引起的感染有较高的治疗效果。作为药物服用时，氯霉素口服后经胃肠吸收，每6 h服用0.5 g，血药浓度维持在 4 μg·mL-1以上；口服 15 mg·kg-1后，2 ～ 3 h达到血药浓度峰值为10～20 μg·mL-1；静脉用药时，同等剂量下的血药浓度峰值稍高于该数值。

但是，食品中残留的氯霉素，经食物链进入人体后会带来严重危害。①长期摄入微量氯霉素，人体会对部分细菌产生耐药性，造成体内正常菌群失调。造成这一情况的原因是细菌在乙酰转移酶的介导作用下，导致氯霉素失活以及部分细菌改变了膜的通透性，导致氯霉素不能进入细菌体内。②氯霉素直接攻击血液系统，会提高再生障碍性贫血、白血病的发生风险，通过血象检查可以进行监测评估。③新生儿和婴幼儿可能发生灰色综合征，表现为腹胀、呕吐、紫绀、呼吸浅表和循环障碍等症状[2]。由于新生儿和婴幼儿的肝脏发育不全，肾脏排泄能力较差，发生灰色综合征的死亡率约为40%。

2 酶联免疫吸附法在食品氯霉素检测中的应用

氯霉素无色无味，消费者在购买、食用过程中肉眼无法鉴别，因此必须采用专业的检测技术手段检测食品中的氯霉素残留。目前常用方法有微生物法、免疫法、色谱法以及光谱法等，本文仅对酶联免疫吸附法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）在食品氯霉素检测中的应用进行介绍。

2.1 反应原理

ELISA法的检测原理是利用抗原与抗体的特异性免疫化学反应，即酶标记物与样品中的氯霉素、微孔中的抗体进行竞争反应[3]。反应过程中，若样品中的氯霉素含量高，竞争反应的酶标记物越多，微孔中抗体与酶标记物的结合减少，显色后氯霉素含量与样品吸光度值呈反比，利用标准曲线即可得出定量结果。

2.2 仪器试剂

ELISA法检测食品中的氯霉素，需要的仪器包括酶标仪、旋转蒸发仪、匀浆器、振荡器、冷冻离心机、微量移液器、电子天平和氮气吹干装置等。使用的试剂均达到分析纯标准，主要有乙酸乙酯、乙腈、正己烷、盐酸溶液、氢氧化钠溶液和氯霉素ELISA试剂盒等。

2.3 操作步骤

样品制备完成后，ELISA法操作步骤如下。①在不同微孔中加入标准溶液，加入完成前处理的样品溶液。②在每一个微孔中加入酶标记物。③溶液与酶标记物充分混合后，置于室温下避光静置温育。④去除微孔中的反应液，加入洗液洗涤，重复进行3次，并使用吸水纸拍干。⑤在微孔中加入底物溶液，充分混合，置于室温下避光静置温育。⑥在微孔中加入反应终止液。⑦使用酶标仪判定波长为450 nm的数据。⑧结果判定。计算样品或标准液吸光度值（B）与零标准吸光度值（B0）的比值；以B/B0值为纵坐标，以标样浓度的对数值为横坐标，绘制标准半对数曲线；根据样品的B/B0值，从曲线上读出对应的浓度，乘以稀释倍数即可。

2.4 技术优势

ELISA法检测食品中的氯霉素，其技术优势包括：①检测范围广，可对鸡鸭、鱼虾蟹、牛奶、血清、肌肉、饲料与蜂蜜等进行检测；②检测效率高，样品预处理简单，不需要复杂的仪器设备，检测数十个、上百个样品仅需几个小时；③检测精度和灵敏度高，回收率在80%～120%。区兑鹏等[4]采用酶联免疫法快速检测水产品中的氯霉素、氟苯尼考、硝基呋喃类代谢物，其灵敏度高、快速简便，适用于水产品的快速批量检测。刘姚等[5]则采用直接竞争ELISA法检测蜂蜜中的氯霉素残留，结果检出限为0.15 ng·g-1，定量限为0.33 ng·g-1，回收率在97.58%～100.94%，批内和批间变异系数小于11%。

3 食品中氯霉素检测结果的影响因素及应对措施

ELISA法检测水产品中的氯霉素具有操作简单、灵敏度高、可批量处理样品等优点，被列为我国的行业标准方法。但在实际检测中，存在假阳性、回收率不稳定等问题，直接影响检测结果的可靠性。基于此，从每一个操作环节入手分析影响检测结果的因素，并提出有效应对措施。

3.1 采样保存

检测水产品中的氯霉素，产品对象主要是鱼类和虾类，如草鱼、鲤鱼、南美白对虾等。鱼虾样品采集后，送检过程中的温度控制在0～5 ℃，保存温度为-18 ℃。制取样品时，先去皮、去壳，再取肌肉组织，最后经均质器均质处理，以上这些操作环节，均可能受到污染，进而影响最终的检测结果。对此，应对措施如下。①鱼虾样品采集时，要选择新鲜的对象，因为发生腐烂或变质的对象有病原菌生长，会分解抗原抗体的蛋白，对酶标记物产生干扰。②制取样品时，不能反复冻融，而是一次性规范操作完成。反复冻融过程中，会改变蛋白质的结构，影响抗原与抗体结合。

3.2 试剂选用

试剂类型的选择、试剂盒运输保存方法、试剂的使用过程，也会影响最终检测结果。对此，应对措施如下。①优选试剂，最好选择同一厂家的配套试剂，确保试剂满足检测试验要求，且处于有效期内。②试剂盒在运输过程中，放在有冰袋的保温盒内，缩短运输时间；保存时温度控制在4～8 ℃。一般情况下，按照说明书中的要求进行保存即可，防止高温导致蛋白变性或活性降低。③试剂盒使用时，从冰箱内取出先在室温下静置30 min，并且充分摇匀。这是因为试剂盒突然置于室温下，可能形成水化层，影响温育时间，出现假阴性结果。④制备试剂时，在空管内先加入稀释液，再加入稀释物，并且充分混匀。

3.3 加样

加样操作中，加样量不精确、加样速度过快，会影响最终的检测结果。对此，应对措施如下。①向微孔加入试剂或样品提取液时，使用移液器操作，对移液器定期校正，确保精准度；一个样品使用一个移液头，避免发生交叉污染。②加样时控制好速度，液体在微孔下方1/3处放注，加在孔壁上部会影响吸附效果；不能产生气泡，会导致读数误差。③样品数量较多时进行分批操作，尽量缩短整个检测用时，避免引起误差。

3.4 温育

温育是ELISA法检测过程的一个重要环节，将微孔板置于恒温箱中或进行水浴处理，该环节看似简单，实际上很容易出现问题。从ELISA法的原理看，抗原与抗体在固相上结合反应，必须有一定的反应条件和时间。温育需要的时间长短和温度高低是反比关系，随着温度增高，需要的时间缩短[6]。但是，温度升高可能导致蛋白质变性，抗原与抗体反应结合物减少，会降低试验敏感性；时间缩短对弱阳性样本不够友好，由于分子含量低，反应不完全易出现假阴性。对此，应对措施如下。①根据试剂盒说明书，确定温育时间和温度，常见的温度包括2～8 ℃、室温、37 ℃和43 ℃；如果说明书中给出2个温度，试验时选择较低的温度，适当延长温育时间，确保抗原与抗体充分反应。②将微孔板置于恒温箱中或进行水浴处理，从室温升高至目标温度需要一段时间，尤其是室温较低的情况下；不考虑这段时间，实际温育时间不够，弱阳性样本可能检测不出来。③“边缘效应”是使用96孔板时，外围孔的显色较深、中心孔的显色较浅；温育时尽量采用水浴法，可以排除这一效应，提高测定的重复性。

3.5 洗涤

洗涤是将反应液中未与抗原抗体结合的物质、干扰性物质排除的过程，虽不是反应步骤，但也会影响最终检测结果。采用ELISA法，一般分为人工洗涤、洗板机洗涤两种方式，应对措施如下。①人工洗涤时，不同微孔中的液体可能交叉，使用吸水纸拍干时应垂直，防止发生交叉污染。②洗板机洗涤时，洗液量不足、洗板针堵塞是常见问题，应经常检查洗液量，及时补充，观察冲洗头是否通畅；洗板后的液体残留及时处理，以提高洗涤效果。

3.6 显色

酶作为一种催化剂，和底物结合后会发生反应。酶与底物的催化反应需要一定时间，而且受到反应温度的影响，一般来说温度越高，反应需要的时间越短。为避免对检测结果造成影响，检验人员应严格按照试剂盒说明书操作，控制好反应时间和温度。显色完成后，及时加入终止液，防止显色变弱甚至消退。

3.7 比色

比色使用酶标仪完成，其原理为酶与底物一一对应，两者反应后生成不同的显色物，它们的有效吸收波长不同[7]。例如，使用HPR催化TMB，生成的显色物有效吸收波长是450 nm。酶标仪对微孔的测定值，决定了检测结果的准确性，测定前使用无尘纸擦除酶标板上的水汽，不要影响酶标仪读数。

3.8 结果计算

氯霉素的残留检测结果，以明确的定量数值进行表示，计算过程与相对吸光值、稀释倍数有关，而且标准半对数曲线的绘制有一定难度，这些因素也会影响检测结果。对此，应对措施如下。①严格按照试剂盒说明书中的要求进行计算，一人计算，另一人核对，保留所有原始数据。②为避免其他因素的干扰，还要做好室内质控工作，包括仪器设备的校正、环境（温度、湿度）检测、测试流程的控制等。

4 结语

综上所述，食品安全关系到人们的健康，落实食品安全检测工作，提高检测结果的准确性，是从业人员关注的要点。本文以ELISA法检测食品中的氯霉素为核心，介绍了技术原理和优势，从各个操作环节分析了影响因素和应对措施，希望为实际检测工作提供参考。食品安全质量检测不仅是社会关注的一个要点，也是保证饮食安全健康的一个重要手段。相关检测机构和检验人员只有认识到这一工作的重要性，不断学习新知识、新技术，提升职业技能和综合素质，才能保证检测结果的准确性和可靠性，为食品安全监督管理提供数据支持。