许瑞雪，毛奕文，马洋洋，蒋学风

暨南大学附属第一医院妇产科，广东 广州 510630

根据2020年全球癌症统计数据显示：宫颈癌(6.5%)、子宫体癌(4.5%)、卵巢癌(3.4%)在女性恶性肿瘤发病率排名中分别居第4、第6、第8位，同时宫颈癌(7.7%)在女性恶性肿瘤死亡率中居第4位[1]。预计2021年美国子宫体癌发病率约7%，占女性恶性肿瘤发病率第4名；卵巢癌死亡率为5%、子宫体癌死亡率为4%，分别居女性恶性肿瘤死亡率第5、6位[2]。卵巢癌、子宫内膜癌和宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤，特别是卵巢癌，因缺乏早期诊断方法，发现时多为晚期；尽管近几年靶向药、PARP抑制剂及免疫检查点抑制剂为部分患者带来获益，但多数患者仍因治疗手段有限而预后差、生存率低。

PIWI/piRNA参与转座子沉默、精子发生、基因组重排、表观遗传调控、蛋白质调控和生殖干细胞维持等生物学过程，并认为与多种恶性肿瘤的生长、侵袭、转移和预后不良密切相关。本文重点阐述PIWI/piRNA在妇科恶性肿瘤中作用机制及最新研究进展，为妇科恶性肿瘤的早期诊断、后续靶向治疗及预测预后提供新的研究方向。

1 PIWI/piRNA的生物学特征

1.1 PIWI家族 PIWI(P-element-induced wimpy testes)最早在果蝇中被发现，是果蝇生殖系中干细胞自我更新和维持所必需的一类保守基因；包含三个不同亚型：ago3、aubergine(aub)、和PIWI。aub和ago3可在细胞质中切割其靶转座子转录，而PIWI可在细胞核的转录水平上调控其靶转座子；PIWI和aub对雄性和雌性的生育能力都是必需的，而ago3对雌性的生育能力是必不可少的[3-4]。小鼠PIWI蛋白家族包括三个成员：MIWI2、MILI和MIWI，均在精子发生的不同阶段呈高度时空特异性表达；而雌性生殖细胞中只有MILI蛋白弱表达。人源PIWI基因位于人类第12号染色体长臂，首先在人类睾丸组织中被发现，目前已证实PIWI基因广泛分布在前列腺、卵巢、小肠、心脏、大脑、肝脏、骨骼肌及肾脏在内的很多组织中[5]。人类PIWI蛋白主要包括PIWIL1(HIWI)、PIWIL2(HIWLI)、PIWIL4(HIWI2)和PIWIL3(HIWI3)四种类型[6]。PIWIL在各种类型的人类癌症中广泛表达，与多种恶性肿瘤的增殖、侵袭、转移和预后密切相关，见表1。

表1 PIWI在多种癌症类型中的表达

1.2 piRNA的来源 piRNA最早在果蝇睾丸初级精母细胞中被发现，其与PIWI蛋白结合介导果蝇X染色体的串联重复序列Stellate基因沉默，从而保证精母细胞正常减数分裂、维持雄性果蝇生殖能力；转座子活化可引起基因组不稳定性，导致精子发育异常[15]。截至2006年有研究发现在果蝇、小鼠、大鼠和人等多个物种生殖系细胞中，存在特异地与PIWI家族蛋白质相互作用的小分子RNA而被命名[16]。piRNA主要来源于基因组中的piRNA簇或转座子区域，与miRNA和siRNA不同，piRNA的前体为长单链转录物，且过程不需要Dicer酶参与，新生的piRNA进行额外的转录后修饰成为成熟piRNA。

1.3 PIWI/piRNA的合成机制 PIWI/piRNA的生物发生包括两条主要途径：一级加工途径和二级乒乓循环扩增途径。首先在细胞核中，piRNA簇被转录生成正义、反义piRNA，反义piRNA转移到细胞质后被核糖核酸内切酶Zuc切割成短片段，PIWI蛋白对piRNA的5'端尿嘧啶表现出强烈偏倚，被加载至5'末端；同时3'末端的2'-羟基被Hen1甲基化，再经核酸外切酶修剪成成熟的PIWI-piRNA复合物(初级piRNA)。部分PIWI-piRNA复合物被运送回细胞核中发挥转座子活性，另一部分PIWI-piRNA复合物与直接被转运到细胞质中的正义piRNA一同进入乒乓循环启动二级扩增[17]。在此循环中，与PIWI亚家族蛋白结合的反义piRNA通过碱基配对识别互补的正义转座子转录本，并切割产生10 nt距离的5'端；随后裂解的产物与PIWI亚家族蛋白结合，最终在3'末端再次加工，产生次级正义piRNA。正义piRNA与其相应的PIWI蛋白偶联，同样识别其互补piRNA以产生次级反义piRNA。通过这个循环，piRNA在细胞质扩增并积累[18-19]，见图1。

图1 PIWI/piRNA的生物合成：一级加工途径和二级乒乓循环途径

2 PIWI/piRNA在癌症中的作用机制

尽管人们认为，PIWI/piRNA的主要作用是沉默生殖细胞中活跃的转座子元素，从而保护基因组不受转座子诱导的插入突变的影响，但越来越多的证据表明，在体细胞基因调控中，PIWI/piRNA同样发挥积极的作用，包括序列特异性DNA甲基化等其他表观遗传学过程，调控癌症的转录及转录后水平[20]。

2.1 沉默转录基因 在乳腺癌的研究中发现：piRNA-021285的过表达可促进促凋亡基因ARHGAP11A的5'非编码区第一个外显子甲基化，使mRNA的表达降低、乳腺癌细胞过度增殖、生长；认为其具有促进癌症发生发展，并诱发肿瘤侵袭的潜在可能[21]。目前普遍认为肺癌、结肠癌、胃癌等恶性肿瘤的发生发展与DNA甲基化相关；而PIWI/piRNA可上调DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)的表达，进而介导抑癌基因的DNA甲基化相关沉默，促使肿瘤发生[22-23]。

2.2 调控mRNA的稳定性 类似于miRNA机制，通过piRNA-RNA相互作用，piRNA可通过调节转录后网络从而抑制目标RNA，这些RNA包括mRNA、lncRNA。在前列腺癌中，piR-001773和piR-017184与PIWIL4结合形成PIWI/piRNA复合物，通过miRNA样机制，介导PCDH9 mRNA的降解，下调原钙黏蛋白9(PCDH9)的表达，从而促进肿瘤细胞的生长、侵袭和迁移[24]。有研究者观察到piR-55490可抑制肺癌细胞中Akt/mTOR途径的激活。同时发现piR-55490通过类似于miRNA的机制，结合mTOR信使RNA的3'非编码区，并诱导其降解从而抑制肺癌细胞增殖。因此认为piRNA可通过直接靶向癌基因mRNA来抑制癌细胞表型[25]。

2.3 与蛋白质相互作用 piR-823在结直肠癌组织中表达上调，并与热休克因子1(HSF1)相互结合，促进其Ser326磷酸化和HSP1活化；通过影响细胞周期进程，抑制细胞凋亡、促进细胞增殖发挥肿瘤促进作用[26]。

2.4 维持肿瘤细胞的干性 粒细胞髓样抑制细胞(G-MDSCs)通过促进多发性骨髓瘤(MM)细胞上调piR-823表达；可激活(DNA甲基转移酶3B)DNMT3B从而增强MM干细胞(MMSC)的干性、提高MM细胞的存活率[27]。另外发现PIWIL2、piR-932在乳腺癌干细胞中表达增加，两者免疫沉淀形成piR-932-PIWIL2复合物；可能通过促进Latxin基因的异常甲基化，参与乳腺癌干细胞的维持，并可能成为阻断乳腺癌转移的潜在靶标[28]。

3 PIWI/piRNA与宫颈癌

研究发现PIWIL2在宫颈癌及癌前病变中表达过度；通过经体内及体外实验证实，在PIWIL2敲除后，癌细胞的生长被有效抑制，初步揭示其可能具有促进宫颈癌发生发展的能力。同时PIWIL2转染后，HaCaT细胞系呈现E-钙黏蛋白下调和N-钙黏蛋白、波形蛋白增多；这一表型变化与上皮间质转化一致，进一步验证其在宫颈癌细胞中潜在促进增殖、迁移和侵袭的能力。并且PIWIL2表达可通过高危HPV E6、E7的组合重新激活、并诱导H3K9乙酰化，激活c-Myc、Nanog、Oct4、Sox2和Klf4等核心体细胞重编程因子，启动细胞重编程，从而促进肿瘤起始细胞的形成[29]。另一研究转染PIWIL2后，检测到典型的Wnt信号异常激活；通过阻断下游β-catenin和CREB结合蛋白，可显著下调重编程因子，从而在PIWIL2过表达的HaCaT细胞中导致细胞分化并防止致瘤性；表明PIWIL2激活的β-catenin/CREB结合蛋白介导的转录对肿瘤起始细胞的维持至关重要，有助于宫颈癌发生的进展[30]。PIWIL2的表达除了可能与宫颈癌发生有关以外，还参与宫颈病变的多个阶段。一项研究在癌性病变相邻的一些化生上皮细胞、恶性病变周围组织学显示正常但分子水平存在隐匿癌前病变的组织也检测出PIWIL2表达，而均检测不到p16表达；认为PIWIL2基因激活可能早于p16激活。另外p16阴性宫颈癌、非HPV感染的宫颈癌、脱落的异常宫颈上皮细胞也检测出PIWIL2，进一步证实PIWIL2在宫颈病变中的表达比p16更为广泛。这项研究为宫颈病变早期阶段的诊断识别以及疾病的进展监测提供了新的视角，提示PIWIL2有潜力成为HR-HVP和p16的互补生物标志物[31]。PIWIL4也在一项18对宫颈癌组织和邻近正常组织的qRT-PCR实验中被检测到差异表达增多，其可能通过抑制p14ARF/p53阻止宫颈癌细胞凋亡，从而促进细胞生长和增殖[32]。另有研究发现宫颈癌细胞中piR-651的表达增加，表明piR-651可能在致癌中发挥关键作用，并可能是潜在的癌基因[33]。

4 PIWI/piRNA与卵巢癌

早期有研究发现卵巢癌的piRNA通路基因表达增加，与邻近正常组织相比，PIWIL1、PIWIL2、PlWlL3和PIWIL4蛋白在晚期卵巢癌原发灶、腹膜、淋巴结转移灶中表达均上调，且可能与转移相关[34]。一项实验针对25例晚期浆液性卵巢癌、8例正常卵巢组织、19例卵巢良性肿瘤进行半定量RT-PCR分析，发现上皮性卵巢癌组织中PIWIL1和MAEL的表达明显增多，同时在邻近肿瘤组织的间质细胞中MAEL和PIWIL2也存在强表达，提示其可能在卵巢癌中发挥作用，并参与癌细胞周围组织细胞组成且可能发生了变化；而令人惊讶地是，在体外实验中却发现PIWIL1和MAEL的过表达降低了卵巢癌细胞的侵袭性，这表明piRNA途径参与肿瘤发生过程的复杂性[35]。另外发现PIWIL2表达增加与卵巢癌的顺铂耐药密切相关，Piwil2在细胞染色质乙酰化和松弛中起作用，可能通过防止异染色质促进染色质松弛，从而增强DNA修复[36]。因此，抑制PIWIL2表达减少肿瘤细胞的修复为人类癌症的治疗干预提供了一种新的手段。有研究者在卵巢正常组织和上皮性卵巢癌全基因组piRNA分析中鉴定出子宫内膜样卵巢癌(ENOCa)和浆液性卵巢癌(SOCa)样本中分别有159、143个piRNA存在差异表达。其中piR-52207在ENOCa中被上调，通过有效靶向下调NUDT4、MTR、EIF2S3和MPHOSPH8基因的表达，表明此种piRNA通过调节这些基因发挥作用，且可能是促进ENOCa肿瘤细胞增殖、迁移以及致癌性增强的原因。此外，在SOCa中上调的PIR-33733通过靶向抑制LIAS的表达以调节SOCa的肿瘤发生；而同样上调的piR-52207靶向降低了ACTR10、PLEKHA5的表达，可能导致细胞骨架和细胞黏附基因的转录调控异常，从而引起癌症进展[37]。因此认为，差异表达的piRNA介导的基因调控网络，可能参与调节卵巢癌发生中涉及的关键过程和途径，并且piNRA途径介导肿瘤发展过程存在复杂性。

5 PIWI/piRNA与子宫内膜癌

在子宫内膜癌中，相关的研究仍在发展阶段，近年来已有研究表明遗传表观变化，如DNA异常甲基化，在Ⅰ型子宫内膜癌中发挥重要作用，这也为进一步研究PIWL/piRNA在子宫内膜癌中的可能机制及诊治提供了思路。有研究将PILWL1转染到Ishikawa细胞，发现PILWL1可以使PTEN基因启动子甲基化，抑制Ⅰ型子宫内膜癌组织中PTEN的表达，并且发现DNMT1可能是PILWL1的下游靶标；进一步表明PILWL1可能通过DNMT1介导的PTEN高甲基化，导致PTEN表达的下调，从而介导Ⅰ型子宫内膜癌的增殖与发展[38]。PILWL1在子宫内膜癌组织中过度表达，可导致癌组织中干细胞标志物(如CD44和ALDH1)表达增加，上皮标志物E-钙黏蛋白下调、间质标志物波形蛋白和N-钙黏蛋白上调，从而调节肿瘤的上皮间质转化及干细胞样特性的获得，并参与维持茎样特征作用；表明PILWL1具有增强子宫内膜癌的增殖、迁移及侵袭潜能[39]。PIWIL1在子宫内膜癌细胞113中高表达，且伴有血管内皮生长因子(VEGF)和血管生成素(Ang)/Tie-2信号显著表达，提示PIWIL1在子宫内膜癌的血管生成中可能也起到重要作用[40]。由此可见，PIWI/piRNA在子宫内膜癌发生发展中具有重要作用，且可能参与包括影响基因甲基化、肿瘤血管形成的多个生物学过程。

6 结语

目前关于PIWI/piRNA在人类各种癌症中的研究已经取得了一定的成果，在妇科恶性肿瘤领域，PIWI/piRNA同样存在异常表达，涉及多种基因表观遗传学变化，与肿瘤的增殖、侵袭和迁移存在广泛联系，但与其他生物通路之间存在的交叉联系有待进一步研究。一些PIWI/piRNA可能作为致癌或者抑癌因子，为肿瘤的诊断、治疗以及预后判断提供新型生物标志物和治疗靶点。目前PIWI/piRNA参与妇科恶性肿瘤发生发展相关机制的研究仍较少，有待进一步深入研究及探讨。