吴亚辉，王韬甫，林洪启*

1.河南省人民医院麻醉科室，郑州 450003；2.华中阜外医院麻醉科室,郑州 450003

当冠心病等心血管疾病发展到一定阶段，药物缓解患者症状后，需要进行外科手术或者介入治疗，心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）不可避免。MIRI能够导致心的生化、形态、结构等发生改变，使患者出现心律失常、代谢障碍、血管内皮功能损伤等心功能障碍[1]。研究表明心肌细胞中氧化应激反应以致活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）富集导致的心肌细胞大量凋亡是MIRI最基本的病理改变[2]。最大限度地减轻由MIRI造成的心功能障碍，降低患者死亡率是临床亟需解决的问题。右美托咪定是在ICU和临床麻醉中广泛应用的镇静和镇痛药物。现代药理学研究表明，作为一种高选择性α2肾上腺素受体激动剂，右美托咪定还具有抗焦虑、抗炎、抗氧化以及良好的器官保护作用[3]。罗建民等[4]报道在经皮冠状动脉介入治疗中，右美托咪定的应用有助于患者术后心功能的恢复，减轻患者术中的MIRI损伤，体现了右美托咪定对心的保护作用。但关于右美托咪定对心保护作用的机制报道较少。蛋白酪氨酸激酶2/信号转导和转录激活因子3（janus kinase 2/signaltransducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3）通路在细胞生长、增殖、凋亡、分化、应激、免疫调节等生理过程中发挥重要作用，冷雪等[5]研究表明激活JAK2/STAT3通路能明显改善急性心肌缺血大鼠的症状。本研究通过建立大鼠心肌缺血再灌注模型，从心肌损伤以及心肌细胞凋亡的角度入手，探讨JAK2/STAT3通路在右美托咪定对心保护作用的可能的机制，为右美托咪定的临床应用提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 8～10周清洁级SD雄性大鼠40只，体重220～250 g，由我院实验动物中心从郑州伊美诺生物技术有限公司采购，动物使用许可证号：SYXK（豫）2017-0005。

1.1.2 主要试剂 盐酸右美托咪定注射液（dexmedetomidine hydrochloride inject，2 ml：200μg，国药准字：H20090248，江苏恒瑞医药股份有限公司）；JAK2/STAT3信号通路特异性激动剂SC-39100购自Sigma公司，HE试剂盒、DCFH-DA染色试剂盒购自上海碧云天生物技术公司；p-JAK2，p-STAT3抗体、兔抗GAPDH购自美国abcam公司，TUNEL试剂盒、Western blot试剂盒购自德国Rebstock公司。

1.1.3 主要仪器 荧光显微镜（日本尼康公司），Biorad凝胶成像系统（美国Bio-rad公司），-80℃深冷冰箱（德国维根斯公司），电镜（日本三菱公司），Leica RM2135组织切片机（德国Leica公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 心缺血再灌注损伤大鼠模型构建 术前12 h禁食，腹腔注射3 mg/L的10%水合氯醛将大鼠麻醉，以仰卧位固定在手术台上，备皮，消毒，连接电极（用以实时监测大鼠的心电图），参照文献[6]切开颈部气管，连接微小动物呼吸机，开胸暴露心，以5/0线将左冠状动脉前降支结扎，收紧线结后，肉眼可见其左心室壁呈现青紫色或苍白色，血压下降，波动减缓，心电图显示ST段明显抬高即为大鼠心肌缺血成功标准，结扎30 min后剪开线结以再灌注120 min，心电图显示ST段呈现回落1/2以上即为再灌注成功。造模术后关胸、缝合伤口，腹腔注射少量青霉素预防感染。

1.2.2 实验分组 将大鼠随机分为4组，每组10只：假手术组、模型组、实验组和对照组。假手术组大鼠仅进行穿线不结扎。实验组、对照组大鼠术前1 h分别腹腔注射5.0μg/kg的右美托咪定、JAK2/STAT3信号通路激动剂SC-39100[7]，假手术组、模型组大鼠注射等剂量的生理盐水。

1.2.3 心彩超仪检査大鼠心功能 再灌注120 min后，各组大鼠麻醉，微小动物心彩超仪检查各组大鼠的心功能。记录左室收缩压（1eft ventricular systohc pressure，LVSP）、左室舒张末压（1eft ventricular enddiastolic pressure，LVEDP）、左室压力上升最大速率（1eft ventricular pressure rise，+dp/dtmax）及左室压力下降最大速率（1eft ventricular pressure drop，-dp/dtmax）。

1.2.4 大鼠心肌组织病理检查 检查心彩超之后，将大鼠诱导麻醉，留取腹主动脉血清5 ml，处死动物。无菌剥离心，吸干水分，封存在液氮中，置于-80℃深冷冰箱中备用。取100 mg各组大鼠心肌组织，HE染色，切片，光镜下观察心肌组织病理改变。

1.2.5 大鼠心肌组织超微结构观察 取100 mg各组大鼠心肌组织，经固定，脱水，包埋，以及醋酸双氧铀（Uranyl Acetate）及枸橼酸铅（lead citrate）染色后，制成50 nm切片，干燥，电镜观察心肌组织超微结构病理改变。

1.2.6 大鼠血清生化指标检测 将血液样本离心，留取血清，采用酶联免疫测定试剂盒（enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA）检测乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌酸磷酸激酶（creafine phosphokinase，CK）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性以及丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量。

1.2.7 TUNEL染色检测大鼠心肌细胞凋亡 取100 mg各组大鼠心肌组织，经固定，冰冻切片，脱水，包埋后，按TUNEL试剂盒要求进行反应，漂洗，脱水，封片，荧光显微镜观察。正常心肌细胞呈现蓝色，凋亡细胞呈现棕色[8]。使用Image 8.0图像分析软件统计分析获取各组大鼠的心肌细胞凋亡率。

1.2.8 DCFH-DA检测大鼠心肌组织ROS水平 取100 mg各组大鼠心肌组织，10%聚甲醛固定2 h，石蜡包埋并切片，10μmol/L LDCFH-DA染色2 h，荧光显微镜下拍照。

1.2.9 Western blot检测大鼠心肌组织p-JAK2，p-STAT3表达水平 取100 mg各组大鼠心肌组织，常规裂解、匀浆、离心后，测定蛋白浓度，电泳分离，转模、封闭，滴加一抗（均为1：500），4℃孵育过夜，次日清洗后加入二抗（均为1：1000），显色，凝胶成像仪下读取各条带灰度值，以GAPDH作为内参，计算目的蛋白相对表达水平。

1.3 统计学分析

数据统计采用SPSS 16.0软件，作图工具采用Graphpad 5.01，组间比较采用t检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 右美托咪定预处理对心肌缺血再灌注大鼠心功能的影响

各组大鼠心彩超检查如图1示，与假手术组相比，模型组大鼠的LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax明显降低（P＜0.05），LVEDP明显升高（P＜0.05）；与模型组相比，实验组、对照组大鼠的LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax明显升高（P＜0.05），LVEDP明显降低（P＜0.05）；对照组与实验组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 彩超仪检查各组大鼠心功能A：假手术组B：模型组C：实验组D：对照组 *P＜0.05，与假手术组相比#P＜0.05，与模型组相比Fig.1 Thecomparison of heart function of ratsin each groupA:Sham operation group;B:Model group;C:Experimental group;D:Control group Compared with the sham operation group,*:P＜0.05.Compared with themodel group,#:P＜0.05

2.2 右美托咪定预处理对心肌缺血再灌注大鼠心肌损伤的影响

HE染色结果如图2所示，假手术组大鼠心肌细胞排列整齐，胞核结构完整，胞质内容物丰富，细胞间质无水肿、坏死现象，心肌纤维排列规则；模型组大鼠的心肌细胞结构以及形态出现明显损伤，细胞肿胀，排列紊乱，核膜破损严重，胞核固缩明显，胞膜或缺损或溶解，细胞间质增大，炎性细胞大量浸润，坏死的细胞增多，心肌纤维排列失去规则，呈现明显的带状梗死灶；实验组大鼠的心肌细胞结构较为正常，间质稍见肿胀，炎性浸润较模型组明显减少，胞膜较为清晰，坏死的细胞数量较少；对照组大鼠的心肌细胞排列较为规则，心肌纤维形态较为规整，细胞间质稍微肿胀，细胞界限较为清晰。

图2 各组大鼠心肌损伤病理 A：假手术组B：模型组C：实验组D：对照组Fig.2 Thepathology of myocardial injury in ratsin each group A:sham operation group;B:model group;C:experimental group;D:control group

2.3 右美托咪定预处理对心肌缺血再灌注大鼠心肌超微结构的影响

电镜下观察各组大鼠心肌组织超微结构改变如图3所示：假手术组大鼠心肌横纹清晰，心肌纤维排列规则，胞核性状正常，线粒体嵴结构、形态和数量正常；模型组大鼠心肌纤维出现大面积溶解现象，胞核明显扩大，核膜破裂，染色质固缩明显，线粒体数量减少，肿胀明显，呈现空泡样变性，嵴结构变短、变疏、断裂或缺失，胶原纤维松散排列；实验组大鼠心肌细胞损伤明显缓解，细胞排列趋于规则，线粒体损伤明显减轻，部分嵴结构清晰可辨；对照组大鼠心肌纤维排列趋于规整，细胞稍见肿胀，少部分线粒体存在空泡样变性，坏死病灶明显减小。

图3 各组大鼠心肌组织超微结构改变 A：假手术组B：模型组C：实验组D：对照组Fig.3 The ultrastructural changes of myocardial tissue in each group of rats A:sham operation group;B:model group;C:experimental group;D:control group

2.4 右美托咪定预处理对心肌缺血再灌注大鼠血清生化指标的影响

ELISA结果如图4所示，与假手术组相比，模型组大鼠血清中LDH、CK活性明显增强（P＜0.05），MDA含量明显升高（P＜0.05），SOD活性明显降低（P＜0.05）；与模型组相比，实验组、对照组大鼠大鼠血清中LDH、CK活性明显降低（P＜0.05），MDA含量明显下降（P＜0.05），SOD活性明显增强（P＜0.05）；对照组与实验组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图4 各组大鼠血清指标比较A：假手术组B：模型组C：实验组D：对照组 *P＜0.05，与假手术组相比#P＜0.05，与模型组相比Fig.4 Thecomparison of serum indexesof ratsin each groupA:sham operation group;B:model group;C:experimental group;D:control group Compared with the sham operation group,*P＜0.05；Compared with themodel group,#P＜0.05

2.5 右美托咪定预处理对心肌缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡的影响

TUNEL染色结果如图5所示，与假手术组相比，模型组大鼠心肌细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）；与模型组相比，实验组、对照组大鼠心肌细胞凋亡率明显降低（P＜0.05）；对照组与实验组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图5 各组大鼠心肌细胞凋亡比较A：假手术组B：模型组C：实验组D：对照组 *P＜0.05，与假手术组相比#P＜0.05，与模型组相比Fig.5 Thecomparison of rat cardiomyocyteapoptosisin each groupA:sham operation group;B:model group;C:experimental group;D:control group Compared with the sham operation group,*P＜0.05；Compared with themodel group,#P＜0.05

2.6 右美托咪定预处理对心肌缺血再灌注大鼠心肌组织氧化应激的影响

大鼠心肌细胞的氧化应激以DCFH-DA染色法检测ROS含量来评价。结果如图6所示，与假手术组相比，模型组大鼠心肌细胞的荧光强度明显增强，ROS含量明显增多（P＜0.05）；与模型组相比，实验组、对照组大鼠心肌细胞的荧光强度明显减弱，ROS含量明显降低（P＜0.05）；对照组与实验组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图6 各组大鼠心肌组织中的氧化应激的比较A：假手术组B：模型组C：实验组D：对照组 *P＜0.05，与假手术组相比#P＜0.05，与模型组相比Fig.6 The comparison of oxidative stress in myocardial tissue of rats in each groupA:sham operation group;B:model group;C:experimental group;D:control group Compared with the sham operation group,*P＜0.05；Compared with themodel group,#P＜0.05

2.7 右美托咪定预处理对心肌缺血再灌注大鼠JAK2/STAT3信号通路的影响

Western blot结果如图7所示，与假手术组相比，模型组大鼠心肌细胞的p-JAK2，p-STAT3蛋白表达明显升高（P＜0.05）；与模型组相比，实验组、对照组大鼠心肌细胞的p-JAK2，p-STAT3表达明显升高（P＜0.05）；对照组与实验组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图7 各组大鼠心组织p-JAK2，p-STAT3蛋白的表达A：假手术组B：模型组C：实验组D：对照组 *P＜0.05，与假手术组相比#P＜0.05，与模型组相比Fig.7 Theexpression of p-JAK2 and p-STAT3 protein in heart tissueof ratsin each groupA:sham operation group;B:model group;C:experimental group;D:control group Compared with the sham operation group,*P＜0.05；Compared with themodel group,#P＜0.05

3 讨论

心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）是患者在血运重建中，心短期会出现缺血、缺氧，而恢复灌注后，心肌损伤并未缓解，反而加重的一种病理状态。心肌缺血再灌注损伤导致心超微结构改变、心功能障碍，再灌注时集聚的ROS会诱发心肌细胞无端坏死，心肌收缩功能减退，尤其围手术期的心肌缺血再灌注损伤可导致患者出现严重的心律失常甚至猝死[9]。因此寻找有效的手段或药物抑制心肌细胞凋亡，降低心肌缺血再灌注损伤，是心肌缺血治疗中亟需解决的重大课题。

研究表明缺血预处理能明显缓解心肌缺血再灌注损伤，但是不同患者对不同药物的吸收、耐受等原因限制了该治疗手段在临床的推广应用。众多临床医师一直在寻找、研究、筛选合适的药物。右美托咪定在1999年已获得美国食品药品监督管理局批准用于重症监护病房患者的镇静、镇痛。近年来，右美托咪定因在围手术期对器官的保护显示了独特的优势，引起广泛关注[10]。研究表明右美托咪定能明显减轻重要脏器诸如肾、肝、肠道、肺、脑等的缺血再灌注损伤[11]。杨玲等[12]临床研究表明右美托咪定预处理能明显抑制心肌凋亡，在冠状动脉旁路移植术中减轻患者的心肌损伤。刘艳秋等[13]临床观察报道右美托咪定预处理在全麻手术中更能改善患者术后心的结构损伤，显示了良好的心保护作用。但是关于右美托咪定在心肌缺血再灌注应用的报道较少。本研究建立心肌缺血再灌注损伤大鼠模型，心彩超显示模型组大鼠的心功能明显降低，HE以及电镜结果显示模型组大鼠心呈现明显的心肌缺血再灌注损伤。而经右美托咪定预处理的实验组心功能明显改善，病理损伤明显缓解。LDH、CK的活性与心肌细胞膜的通透性关系密切，是衡量心结构损伤的重要因素；患者血清中LDH、CK活性是临床诊断心绞痛、心梗等心肌损伤的金标准，是评价心血管患者远期预后的重要指标[14]。本研究中实验组LDH、CK活性明显降低，说明右美托咪定预处理能明显改善心肌缺血再灌注大鼠的心肌损伤。

研究表明ROS异常集聚导致心肌细胞凋亡是心肌缺血再灌注损伤心结构改变的关键因素[15]。Zhao等[16]研究证实下调氧化应激的水平，减少ROS在细胞的积累，能明显改善心肌缺血再灌注损伤大鼠的心肌凋亡。Guo等[17]报道缺血预处理能降低心肌细胞的异常凋亡，减轻心肌缺血再灌注损伤大鼠的脏器损伤。本研究结果显示经右美托咪定预处理，实验组大鼠血清中氧化应激底物MDA的含量明显降低，参与抗氧化还原的SOD的酶活性明显降低，ROS含量、心肌细胞凋亡率明显降低，说明右美托咪定预处理可抑制心肌细胞的氧化应激，阻滞心肌细胞的凋亡，这与既往的研究结果一致。

JAK2/STAT3信号是机体内涉及炎性、免疫、细胞凋亡、氧化应激等多种病理过程的重要转导通路。研究表明细胞在激活JAK2／STAT3信号后，首先活化JAK2，进一步将STAT3磷酸化，将胞外信号转至胞核，调控靶基因的表达，发挥生物学效应[18]。Xie等[19]研究证实在心肌缺血再灌注大鼠中，激活JAK2/STAT3信号能明显增强抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，降低细胞凋亡。Shang等[20]研究表明在缺氧-复氧损伤的心肌细胞中，JAK2/STAT3信号的激活能明显抑制细胞的氧化应激，降低ROS积累。本研究将JAK2/STAT3信号激活剂用于对照组动物中激活JAK2/STAT3信号，促进JAK2和STAT3的磷酸化，以发挥对心的保护作用，结果显示对照组大鼠的病理指征、血清指标，以及其他指标与实验组的差异不明显。说明右美托咪定预处理对心的保护作用可能与JAK2/STAT3信号的激活有关。

综上所述，右美托咪定预处理能明显降低大鼠心肌缺血再灌注损伤，降低心肌细胞凋亡，可能与激活JAK2/STAT3信号，抑制氧化应激有关。但是对临床上缺血再灌注损伤患者的应用还需要更深入的研究。