王蓓蓓 朱联旭 李崇勇 刘欣

摘要 [目的]通过实验室能力验证活动分析了影响玉米粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）检测结果的主要因素。[方法]依据GB 5009.111—2016第二法：免疫亲和层析净化HPLC法检验并优化前处理条件。[结果]采用5倍稀释浓度提取1 h和3 mL/min的净化速度，能力验证样品中DON含量为571 μg/kg，RSD为0.25%。[结论]通过了中国食品药品检定研究院组织实施的NIFDC-PT-228《玉米粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定》能力验证，与中国食品药品检定研究院统计Z比分值为0.70，能力验证结果为满意，细化完善了国标测定脱氧雪腐镰刀菌烯醇的操作，为广大检验检测人员提供参考。

关键词 脱氧雪腐镰刀菌烯醇;能力验证;玉米粉;高效液相色谱法

中图分类号 TS 201.6  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2022）01-0177-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.01.047

Proficiency Testing for Determination of Deoxynivalenol in Corn Flour

WANG Bei-bei1，2， ZHU Lian-xu3， LI Chong-yong1 et al

（1. Hanzhong Testing and Inspection Center for Food and Drug Control， Hanzhong， Shaanxi 723000;2. College of Biological Science and Engineering， Shaanxi University of Technology， Hanzhong， Shaanxi 723000;3. Zhenba County Market Supervision Administration， Zhenba， Shaanxi 723600）

Key words [Objective]Through a laboratory proficiency testing activity， the main factors affecting the detection results of deoxynivalenol in corn flour were analyzed. [Method]According to the second method of the national standard GB5009.111-2016 to check and optimize the pretreatment conditions.[Result]

Under the conditions of extraction at 5 times of dilution concentration for 1 h and 3 mL/L flow rate， the DON content in the ability verification sample was 571 μg/kg， RSD was 0.25%.

[Conclusion]Passed the NIFDC-PT-228 “Deoxynivalenol Determination of Deoxynivalenol in Corn Flour” proficiency test organized and implemented by the China Institute for Food and Drug Control， and the Z score with the organizer was 0.70. The proficiency test results were satisfactory， and the national standard determination of deoxynivalenol has been refined and perfected to provide a reference for the majority of inspection and testing personnel.

Key words Deoxynivalenol;Proficiency testing;Corn flour;High performance liquid chromatography

基金项目 汉中市地产食品质量监控与品质提升创新团队基金项目（201902）。

作者简介 王蓓蓓（1984—），女，陕西榆林人，硕士，从事食品检验检测与质量控制研究。

通信作者，高级工程师，从事食品药品质量安全控制、生产工艺与检验检测研究。

收稿日期 2021-04-25

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）又称呕吐毒素，是一种主要由禾谷镰刀菌和粉红镰刀菌产生的单端孢霉烯族毒素，也是粮食中重要的食品安全指标。人和动物食用了被 DON 污染的食物后，会产生厌食、呕吐、腹泻、发烧等急性中毒症状，严重会导致死亡[1]。DON化学性质较稳定，玉米、小麦、大麦等谷物及其加工产中广泛存在[2]。近年来，我国谷物受到DON污染日益严重，尤其是小麦粉及其制品、玉米等。从含量上看，小麦粉制品中，饼干中DON的污染状况较重，而玉米由于生长期较长且正值雨季，更易被镰刀菌污染，是目前污染最严重的谷物之一[3-4]。我国是玉米生产大国，玉米不仅是食品原料，也是饲料原料，饲料通过肉、蛋、奶等食物链最终影响人类营养和健康，因此其安全影响巨大[5]。在潮湿、温热等气候条件下，更易产生DON毒素，并经由谷物或饲料通过食物链传递富集至人体内，给世界粮食产业形成庞大的经济损失[6]。据世界卫生组织、欧洲食品安全局等机构的广泛调查评估，过去10年，原糧中的DON感染率达58%，将DON列为最危险的食品污染物之一，美国、日本、欧盟等地区和国家已经就食品中的真菌毒素含量作出严格规定[7-8]。

国家农业、粮食、市场监管等部门为了更加准确地把握谷物粮食中的 DON污染状况，每年都在全国开展各类粮食产品中DON的监督抽查和风险监测，且在GB 2761—2017中对食品中DON采取了严格的限量标准：玉米、玉米面的DON 含量≤1 000 μg/kg;大麦、小麦、麦片、小麦粉的DON含量≤1 000 μg/kg[9]。目前，对于DON的检测有高效液相色谱法、高效液相-串联质谱法、薄层色谱法、酶联免疫法和生物芯片技术，通过持续开展检测评价，逐步提升实验室毒素检验检测能力，对于评估我国粮食毒素污染程度，保障粮食安全有着至关重要的意义[5，10]。因此，准确评价谷物制品中DON含量是现阶段食品和粮食安全的必然要求。

为了切实提升实验室的检验能力和人员的技术水平，2019年参加了中国食品药品检定研究院组织实施的NIFDC-PT-228《玉米粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定》能力验证，样品编号TF228-0054，笔者在查阅相关文献[11-17]和结合自身实验室条件下，按照GB 5009.111—2016第二法免疫亲和层析净化高效液相色谱法[18]，剖析了各环节中可能影响玉米粉中DON含量测定结果的要点，并对前处理的条件进行了优化，为今后相关检测检验提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

玉米粉（编号：TF228-0148），中国食品药品检定研究院提供。DON标准溶液：100.10 μg/mL（Rome labs Lot# L18492D）。玉米粉中DON质控样：（569±60） μg/kg（Rome labs Lot# M15361D）。

分析天平（日本岛津d=0.01 g）;氮吹仪（睿科科技有限公司）;水浴恒温振荡器（常州亿能实验仪器厂）;高效液相色谱仪（日本岛津LC-20AD）;C18色谱柱（月旭科技有限公司4.6 mm×250 mm，5 μm）;DON免疫亲和柱3 mL（Rome labs）;Milli-Q纯水机（美国密理博公司）。

甲醇（色谱纯，赛默飞世尔科技中国公司）;氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾（分析纯，成都科龙化学用品有限公司）;试验用水：符合GB/T 6682—2016《分析实验室用水规格和试验方法》一级水的要求。

1.2 方法

参考GB5009.111—2016第二法免疫亲和层析净化HPLC法进行试验[19]。统计方法用SPSS进行统计分析，差异性检验水准为α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

1.2.1 样品的制备。

该试验能力验证样品为玉米粉，样品用铝塑袋真空包装，每瓶装量约30 g，常温避光保存[10]。能力验证作业指导书要求一次取样量不少于5 g，样品称量前稳定至室温（20～25 ℃）。

1.2.2 样品的提取。

提取溶剂主要为超纯水，提取方式为超声波或者摇床振摇，该环节主要研究样品稀释倍数、提取时间对结果的影响。该试验分别对质控样品稀释3、5、8倍，摇床振摇时间分别为0.5、1.0、2.0 h。

1.2.3 样品的富集净化。

研究净化液过免疫亲和柱时流速对结果的影响，分别对质控样净化液采取1、3、6 mL/min的速度进行净化分析。

1.2.4 液相色谱条件。

流动相：甲醇-超纯水（20∶80，V/V）;进样量：50 μL;检测波长：218 nm;流速：1 mL/min;柱温：35 ℃;色谱柱：月旭C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

标准物质选用Rome labs的有证标准物质，赵晶晶等[19]通过用超高效液相色谱法测定了玉米中DON含量，剖析了不确定度各因素的影响后得出，质量浓度、测量重复性、体积量取是影响测定结果不确定度的主要因素。经过预试验以及加标浓度的考虑，选取100～1 000 ng/mL线性范围，使得待测样品浓度尽量在线性中间区域，在该线性范围内曲线方程为：y=59.56x+159.60，R2=0.999（图1、2）。标准储备溶液、标准点的稀释溶液应与流动相一致以降低溶剂效应，配置标准储备溶液与标准曲线选取应选用校准的移液管（移液枪）和容量瓶，尽量减少转移次数，将标曲配制及稀释过程带来的不确定度降至最低。

2.2 样品提取

分别对质控样品用水稀释3、5、8倍，摇床振摇0.5、1.0、2.0 h后，提取过滤净化，以3 mL/min的速度净化测定质控样品，结果见表1。由表1可知，振摇0.5 h稀释5倍和8倍结果差异不显著（P>0.05），稀释3倍和5倍结果差异显著（P<0.05）;振摇1.0 h和振摇2.0 h差异不显著（P>0.05），振摇1.0 h和振摇0.5 h差异显著（P<0.05）。结合试验提取效果和时间成本，避免由于稀释液不足及振摇时间短造成的提取不充分，以5倍稀释振摇1.0 h为最佳选择。

2.3 样品净化

由于玉米粉基质比较复杂，含有天然的色素、脂类、蛋白质等有机物质，对样品的检测干扰较大，为了降低基质的影响，用免疫亲和柱对提取液进行净化处理[10]。试验前需验证免疫亲和柱的柱容量，柱回收率是否满足要求。柱容量验证、柱回收率验证方法按照GB5009.111-2016附录A。5 mL超纯水中加入6 000 ng DON 标准储备溶液，混合均匀，分别取同一批次免疫亲和柱各3 根，每根免疫柱的上样量为1 mL，经过洗脱富集后用氮气吹干，流动相定容至1 mL，HPLC分离测定DON含量[9]。6支亲和柱的测定结果分別为1 120、1 135、1 080、1 050、1 103、1 060 ng，柱容量≥1 000 ng，柱回收率≥80%，为可使用商品。

使用前，将免疫亲和柱从冰箱中取出放至室温。样液上柱量、洗脱方法依据不同厂家的产品说明严格规范操作，质控样采用不同流速净化，1、3 mL/min结果差异不显著（P>0.05），3、6 mL/min结果差异显著（P<0.05）（表2），考虑到整个试验的效率和结果，确定3 mL/min为最佳净化流速。

2.4 质控样及加标回收

由于样品量受限，对质控样品以5倍稀释和3 mL/min流速净化后进行测定，并进行低、中、高3个浓度的加标回收试验，结果表明回收率在76.8%～89.4%，RSD在1.69%～5.05%（表3）。质控样色谱图见图3、4。

2.5 能力验证结果

通过用质控样对前处理进行优化后，能力验证样品最终采用5倍稀释的超纯水振摇1 h后，以3 mL/min的流速，按照GB 5009.111—2016的方法检测，结果表明DON含量为571 μg/kg，RSD为0.25%，检测结果与能力验证结果Z比分值为0.70，能力验证结果为满意。

3 讨论

能力验证是衡量实验室检测结果可靠性和可比性的最常用方法之一，毒素的能力验证不仅是粮油真菌毒素实验室检测质量控制的重要手段，还是提高实验室粮油真菌毒素检测结果可信度的重要保证[20]。能力验证包括国内实验室（间）比对和国际实验室（间）比对，参加国内实验室（间）能力验证，有助于监督实验室的检验检测能力及其能力维持状况。参加国际实验室间检测能力验证，有助于实验室及时领会贯通国际相关领域检测能力验证的政策和要求，促进该领域检测能力的提高和交流合作[21]。

胡桂英[1]用高效液相色谱法测定了小麦粉中DON含量，且评估了不确定度评定的影响因素，指出前处理过程和计量器具校准引入的不确定度为测量不确定度的主要来源。因此在试验过程中，检验人员主要把握样品前处理环节，严格按照国标和仪器说明书操作，降低误差，以提高检测结果的准确度。该研究在试验前经过资料查询和模拟预试验，选取最佳前处理方案，并在检测过程中进行质量控制，顺利通过能力验证。

DON对人和动物都有一定的毒性，且性质稳定，耐酸耐碱耐高压，普通的食品加工方法难以使其降解，120 ℃高温、强碱或高压才能破坏部分毒素[11]。因此，试验过程中操作人员在处理阳性样品和配制标准溶液时需做好个人防护，试验结束后用5%次氯酸钠溶液浸泡所有容器和废弃物，擦拭桌面，避免造成二次污染。

该研究结果表明，DON含量为571 μg/kg，与中国食品药品检定研究院统计Z比分值为0.70，能力验证的结果为满意。能力验证的通过证明了该研究具备DON项目的检验能力，对检验人员而言也是积累经验及能力提升的过程。通过参加能力验证，可以有效提高实验室质量管理水平和检验检测能力，对实验室的能力建设和服务地方经济水平具有积极作用。

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