贾纯亮，梁 磊，张 磊，李翰嵩，王 剑，刘远廷

(河北省唐山市人民医院胃肠外科 063000)

胃癌是临床常见恶性肿瘤，严重威胁患者生命安全，晚期患者中位生存期不到12个月，因此，早期预防和治疗至关重要。许多因素均可影响胃癌的进展，包括遗传和环境因素等，微生物作为肿瘤环境的一部分，在胃癌发生、发展和转移过程中发挥着重要作用，胃癌的发生、发展与微生物结构变化高度相关[1]。幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是一种革兰阴性微需氧菌，定植于胃黏膜，是慢性胃炎及消化道溃疡的主要发病原因，感染后可直接作用于胃黏膜和上皮细胞，破坏胃黏膜细胞屏障，引起胃炎，之后演变为慢性活动性胃炎，持续感染Hp可触发炎症级联反应，增加发生胃癌的风险[2]。Hp感染的流行程度与地区、种族及社会经济地位不同有关，各年龄段人群均可感染，发展中国家感染率更高。据文献报道，Hp定植率超过50%，就很难自行消除，导致终身感染，1%～3%的感染者会发展成为胃癌，根除Hp可有效降低胃癌发生率。目前尚缺乏彻底、有效清除Hp的方法，因此，深入研究其感染机制，对清除Hp具有重要意义[3]。核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)是调控基因转录的重要因子，参与机体炎性反应及免疫应答等多种病理生理过程，其过度表达与多种慢性炎症性疾病及肿瘤发病机制相关[4-5]。炎性反应和慢性感染可提高胃癌发病率，Hp持续感染后NF-κB呈激活状态，并介导炎症级联反应[6]。YANG等[7]研究表明，Hp感染诱导的慢性炎症和胃癌与NF-κB有关。目前，关于Hp感染引起胃黏膜炎症的发病机制尚不十分明确，本研究探讨NF-κB通路在Hp长期感染小鼠致胃癌中的作用，并从慢性炎症角度探讨Hp长期感染导致胃癌的可能机制，以期为临床治疗提供靶点和依据。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株：Hp悉尼株(含vacA和cagA基因)，购自美国模式培养物集存库。实验动物：无特定病原体(SPF)级雄性C57BL/C小鼠160只，6周龄，平均体重(20±2)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2017-0011]，购入后于23～25 ℃、相对湿度50%～70%、明暗交替12 h/12 h、清洁通风环境中适应性饲养7 d。主要试剂：哥伦比亚琼脂培养基购自英国Oxoid公司；Hp检测试剂盒购自上海通蔚生物科技公司；小鼠白细胞介素-18(interleukin-18，IL-18)、IL-10、γ-干扰素(interferon factor-γ，IFN-γ)酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒、兔抗小鼠核苷酸结合寡聚化结构域1(nucleotide-binding oligomerization domain 1，NOD1)、受体相互作用蛋白2(receptor interacting protein 2，RIP2)、NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65(phosphorylation，p-NF-κB p65)一抗及辣根过氧化物酶标记的二抗均购自美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1菌株培养

Hp菌株于37 ℃水浴复苏，接种于哥伦比亚琼脂培养基，在微需氧环境(5% 氧气，10%二氧化碳，85%氮气)中，湿度大于或等于95%，37 ℃恒温培养72 h。

1.2.2Hp菌株感染小鼠模型

将培养基中的Hp菌株刮下，鉴定后与磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)混合，检测菌液浓度，调整至1×109菌落形成单位/mL备用。实验前所有小鼠禁食12 h，禁饮4 h。将160只小鼠分为模型组和对照组，每组80只，模型组小鼠给予Hp菌液灌胃，每只1 mL，每48 小时灌胃1次，连续灌胃5次；对照组小鼠给予等体积PBS灌胃，干预频次与模型组相同。所有小鼠灌胃后禁食、禁饮4 h。

1.2.3组织取材

分别于最后1次灌胃结束后18、36、54、72周，两组均取20只小鼠，摘除眼球取血，保存于抗凝管中。开腹取胃，观察胃部大体形态之后分离胃黏膜组织，分为3份，1份用于Hp检测，1份用4%多聚甲醛固定，用于病理组织学观察，1份保存于液氮中，用于 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和Western blot检测。

1.2.4ELISA检测血清IL-18、IFN-γ、IL-10水平

取小鼠全血，3 000 r/min离心5 min，留上清液，按ELISA试剂盒说明书操作，加样37 ℃孵育30 min，用PBS洗涤；加入一抗工作液37 ℃孵育60 min，用PBS洗涤；加入酶标抗体工作液37 ℃孵育60 min，用PBS洗涤；显色，终止反应后，450 nm波长处读取吸光度值，根据标准曲线计算血清样品中IL-18、IFN-γ、IL-10水平。

1.2.5Hp检测

应用快速尿素酶试验，采用Hp检测试剂盒将胃黏膜组织放入其中，30 min变为紫红色或红色则判定为阳性。Giemsa染色，取在4%多聚甲醛中固定的胃黏膜，液体石蜡包埋后连续切片，片厚约4 μm，二甲苯脱蜡、梯度浓度乙醇脱水，2% Giemsa染色30 min，脱水、透明、封片，显微镜下观察，Hp菌体呈蓝色表示阳性。快速尿素酶试验和Giemsa染色二者均为阳性表示Hp感染。

1.2.6苏木精-伊红(hematoxylin eosin，HE)染色观察胃黏膜病理学变化

取胃黏膜组织切片，二甲苯脱蜡、梯度浓度乙醇脱水，常规HE染色，脱水、透明、封片，显微镜下观察。胃黏膜病理改变判定标准[8]：(1)慢性胃炎，淋巴细胞、嗜酸粒细胞和中性粒细胞浸润；(2)萎缩性胃炎，胃黏膜固有层幽门腺或胃底腺萎缩、减少或消失，伴(不伴)炎性细胞浸润，黏膜肌增厚，肌纤维伸向固有层；(3)肠化生，萎缩的胃黏膜腺体被肠腺代替；(4)异型增生，包括胃黏膜上皮细胞形态改变和腺体结构异型性；(5)胃腺癌，腺体增生明显，细胞间异型性明显，基底膜破坏，腺上皮浸润。所有组织切片采取盲法由专人读片。参照MIYASHITA等[9]的方法对黏膜炎症情况进行评分，0分为无明显病理损伤，5分为出现严重损伤，评分越高表示炎症损伤越严重。

1.2.7qRT-PCR检测胃黏膜NOD1、RIP2、NF-κB p65 mRNA表达

取液氮中保存的胃黏膜组织，Trizol法提取总RNA，检测浓度和纯度，逆转录合成cDNA，进行qRT-PCR检测。所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，见表1。配制反应体系：模板cDNA 2 μL，上、下游引物各0.5 μL，SYBR®Premix Ex TaqTM(2×)10 μL，加双蒸水至总体积25 μL。反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环。以β-actin为内参基因，采用2-ΔΔCT法计算NOD1、RIP2、NF-κB p65 mRNA相对表达水平。

表1 引物序列

1.2.8Western blot法检测胃黏膜NOD1、RIP2、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达

取液氮中保存的胃黏膜组织，加入RIPA裂解液，冰上匀浆，12 000 r/min离心30 min，取上清液，采用蛋白质定量(BCA)法进行蛋白定量，100 ℃水浴蛋白变性，采用十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳法进行电泳，转至PVDF膜，加入封闭液后摇床室温封闭2 h。将PVDF膜加入稀释的NOD1(1∶500)、RIP2(1∶500)、NF-κB p65(1∶800)、p-NF-κB p65(1∶800)一抗中4 ℃过夜，洗膜，加入相应二抗(1∶2 000)，室温封闭1 h，洗膜。加入电化学发光液，曝光、拍照，采用Image J软件分析条带灰度值。计算目的蛋白相对表达水平(目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值)。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 血清IL-18、IFN-γ和IL-10水平

模型组小鼠18、36、54、72周血清IL-18、IFN-γ水平均明显高于对照组，IL-10水平均明显低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组小鼠各时间点血清IL-18、IFN-γ、IL-10水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；模型组小鼠血清IL-18、IFN-γ水平随时间延长而升高，IL-10随时间延长而降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1。

A：IL-18水平；B：IFN-γ水平；C：IL-10水平；a：P<0.05，与同组18周比较；b：P<0.05，与同组36周比较；c：P<0.05，与同组54周比较；d：P<0.05，与对照组同时间点比较。图1 各组小鼠不同时间点血清IL-18、IFN-γ、IL-10水平比较

2.2 胃黏膜Hp定植情况

对照组小鼠各时间点胃黏膜尿素酶试验及Giemsa染色均为阴性，无Hp感染；模型组小鼠18、36、54、72周胃黏膜快速尿素酶试验及Giemsa染色均为阳性，Hp定植率为100%。

2.3 胃大体情况

对照组小鼠胃黏膜表面光滑，色泽均匀，呈淡红色，无充血、水肿、溃疡等明显病变。模型组小鼠18周时出现散在出血灶，水肿，颜色加深；36周时出现条索状出血灶，广泛水肿，呈红色，部分出现糜烂、溃疡，胃黏膜发生萎缩；54周时出血灶增加，多处溃疡，胃黏膜表面发白，出现肠化生；72周时胃黏膜受损程度加重，胃黏膜溃疡，重度糜烂，黏膜增厚，见图2。

A：对照组；B：模型组18周；C：模型组36周；D：模型组54周；E：模型组72周。图2 各组小鼠胃大体情况

2.4 胃黏膜病理变化情况

对照组小鼠胃黏膜上皮细胞排列整齐，结构正常，无明显病变；模型组小鼠18周时出现明显中性粒细胞和淋巴细胞浸润，存在炎性反应；36周时炎症进一步加重，淋巴细胞大量浸润，出现萎缩性胃炎；54周时出现异型增生及肠化生等癌前病理表现；72周时胃黏膜以慢性胃炎为主，并出现萎缩性胃炎、异型增生、肠化生及腺癌，20只小鼠全部有慢性胃炎表现，发生率为100%，18只小鼠出现萎缩性胃炎，发生率为90%，15只小鼠出现肠化生，发生率为75%，10只小鼠出现异型增生，发生率为50%，7只小鼠出现胃腺癌，发生率为35%。对照组小鼠无炎性反应，模型组小鼠18、36、54、72周炎症评分分别为(2.03±0.32)、(2.98±0.35)、(3.67±0.41)、(4.36±0.46)分，炎症评分随时间延长逐渐升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

A：正常胃黏膜；B：胃黏膜发生炎症；C：胃黏膜发生萎缩；D：胃黏膜发生肠化生；E：胃黏膜发生异型增生；F：胃黏膜腺癌。图3 胃黏膜病理变化情况(HE，200×)

2.5 胃黏膜NOD1、RIP2、NF-κB p65 mRNA表达水平

模型组小鼠18、36、54、72周胃黏膜NOD1、RIP2 mRNA相对表达水平均明显高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组小鼠各时间点胃黏膜NOD1、RIP2、NF-κB p65 mRNA相对表达水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；模型组小鼠胃黏膜NOD1、RIP2 mRNA相对表达水平随时间延长而升高，差异有统计学意义(P<0.05)；模型组小鼠各时间点NF-κB p65 mRNA相对表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图4。

A：NOD1 mRNA表达；B：RIP2 mRNA表达；C：NF-κB p65 mRNA表达；a：P<0.05，与同组18周比较；b：P<0.05，与同组36周比较；c：P<0.05，与同组54周比较；d：P<0.05，与对照组同时间点比较。图4 各组小鼠不同时间点胃黏膜NOD1、RIP2、NF-κB p65 mRNA表达水平比较

2.6 胃黏膜NOD1、RIP2、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达水平

模型组小鼠18、36、54、72周胃黏膜NOD1、RIP2、p-NF-κB p65蛋白相对表达水平均明显高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组小鼠各时间点胃黏膜NOD1、RIP2、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白相对表达水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；模型组小鼠胃黏膜NOD1、RIP2、p-NF-κB p65蛋白相对表达水平随时间延长而升高，差异有统计学意义(P<0.05)；模型组小鼠各时间点NF-κB p65蛋白相对表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图5、6。

图5 各组小鼠不同时间点胃黏膜NOD1、RIP2、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达电泳图

A：NOD1蛋白表达；B：RIP2蛋白表达；C：NF-κB p65蛋白表达；D：p-NF-κB p65蛋白表达；a：P<0.05，与同组18周比较；b：P<0.05，与同组36周比较；c：P<0.05，与同组54周比较；d：P<0.05，与对照组同时间点比较。图6 各组小鼠不同时间点胃黏膜NOD1、RIP2、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达水平比较

3 讨 论

大量微生物构成重要的微生态系统，在维持人体健康方面发挥着复杂作用。人体胃肠道中存在多种微生物菌群，可能导致癌症在内的多种疾病的发生，已经证实，微生物菌群是影响结直肠癌、口腔鳞状细胞癌等的关键环境因素[10-11]。Hp是引起消化道溃疡、慢性胃炎、消化系统肿瘤的重要病原微生物，被WHO列为胃癌的Ⅰ类致癌物[12-14]。流行病学研究显示，胃癌可发生于Hp感染的胃黏膜，而无Hp感染的胃黏膜不发生胃癌[15]。尽管多项研究证实胃癌与Hp感染有关，但其具体机制仍不十分清楚，通过建立Hp感染动物模型研究相关机制，对降低胃炎及胃癌发病率至关重要。

胃癌患者中约有90%的非贲门区胃癌病例与Hp感染有关，Hp感染引起胃腺癌的过程为胃炎、萎缩、肠化生、异型增生、癌，Hp感染引起胃底黏膜发生炎性反应，造成胃黏膜萎缩和肠化生，导致胃黏膜异型增生，最终引起分化型腺癌，伴Hp感染的慢性胃炎及萎缩性胃炎等病理改变的人群发生胃癌的风险更高[16-17]。本研究采用多次高浓度Hp连续攻击小鼠，对照组小鼠各时间点Hp均为阴性，模型组小鼠各时间点均有Hp检出，表示建模成功，连续饲养72周小鼠胃黏膜显示，从正常至慢性胃炎、萎缩性胃炎、肠化生、异型增生及胃腺癌的病理过程，胃癌发生率为35%，证实长期慢性Hp感染可导致胃癌。Hp感染发病机制包括自身毒力因子作用、诱发机体炎症和免疫反应及宿主因素三方面，其诱发的炎性反应以淋巴细胞等浸润胃黏膜为特征，多种细胞因子在炎症细胞激活和趋化过程中发挥了重要作用，通过释放大量活性物质形成级联炎症效应，造成组织损伤。IL-18是一种中性粒细胞趋化因子，主要来源于胃黏膜上皮细胞，Hp入侵后促进IL-18大量分泌，引起黏膜局部炎性反应，产生溃疡[18]。Hp定植于胃黏膜，抗原持续刺激可诱发局部特异性免疫反应。有研究表明，Hp感染后胃黏膜以Th1型免疫应答为主，通过分泌IFN-γ等细胞因子，对胃黏膜造成损伤[19]。IL-10为抑炎性细胞因子，可抑制多种炎症介质的释放，减轻炎性反应。本研究结果显示，模型组小鼠各时间点血清IL-18、IFN-γ水平均明显高于对照组，且随时间延长逐渐升高，而IL-10水平明显低于对照组，且呈逐渐下降趋势，同时胃黏膜损伤进一步加重，提示Hp感染引起的炎症与IL-18、IFN-γ、IL-10等炎性细胞因子水平失衡有关。

胃癌发病机制复杂，与多基因、多通路异常有关，其中细胞内信号传导通路失调是其重要的发病机制之一，致癌物质的入侵及炎症因子通过活化细胞生存信号促进肿瘤形成。NF-κB常以p50/p65二聚体存在于细胞中，NF-κB p65异常活化参与了多种细胞因子、趋化因子、生长因子的转录调节，与胃癌发生、发展密切相关。NOD1通过识别细菌细胞壁肽聚糖结构，激活下游RIP2，进而活化NF-κB等信号通路，诱导IL-1β、TNF-α等炎性细胞因子的表达和分泌，引起一系列免疫应答反应[20]。Hp感染后可与NOD1结合，活化NF-κB，调节各种炎症因子、趋化因子及生长因子的表达，参与细胞增殖、分化、凋亡等过程，通过改变细胞间黏附能力促进上皮间质转化及诱导基因突变等，在炎症及肿瘤形成过程中发挥了重要作用[21-22]。本研究结果显示，模型组小鼠各时间点NOD1、RIP2 mRNA和蛋白及p-NF-κB p65蛋白表达均明显升高，且随时间延长逐渐升高，与胃黏膜病理严重程度趋势一致，提示NF-κB通路在Hp感染小鼠模型中被激活，参与炎性反应，与胃黏膜损伤有关。

本研究证实，NF-κB通路在Hp感染小鼠胃癌模型中被激活，并可促进炎症因子分泌，进而损伤胃黏膜。鉴于NF-κB通路活化对胃癌发生的促进作用，可假设NF-κB作为治疗靶点，为临床靶向治疗提供依据，但具体研究结论尚有待于进一步证实。