罗 文，邝惠芳，王 婧

(1.海南医学院第一附属医院口腔科，海口 570102；2.海南医学院口腔医学院，海口 571199)

来源于牙体组织的牙源性干细胞/祖细胞用于牙周疾病模型中具有良好的可行性和可预期性[1]。牙囊细胞(dental follicle cells,DFC)是牙周组织的前体细胞，其中包括牙槽骨成骨细胞、成牙骨质细胞和牙周成纤维细胞[2]。DFC成骨分化的不同阶段和相关基因表达与众多信号通路相关，如Notch、转化生长因子-β(TGF-β)/骨形态发生蛋白(BMP)和WNT通路[3]。Notch通路通过Notch受体与膜结合型配体，如Jagged-1结合介导相邻细胞间的信息交流。位于细胞表面的受体Notch和配体(如Jagged-1)结合后被γ分泌酶分解。胞内活化域(NICD)释放并易位到细胞核中与RBP-JK结合，从而调控细胞增殖与分化[4]。本研究探讨在大鼠DFC成骨分化时Notch信号的表达情况变化，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

SD大鼠购自海南医学院药物安评中心;α-MEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶均购自美国Hyclone公司;青霉素、链霉素、抗坏血酸、Ⅰ型胶原酶、Triton、牛血清清蛋白(BSA)、茜素红、二脒基苯基吲哚(DAPI)均购自美国Sigma公司;小鼠抗大鼠波形蛋白(Vimentin)单克隆抗体购自美国 Thermo公司，小鼠抗大鼠细胞角蛋白-14(CK-14)单克隆抗体购自英国Abcam公司;山羊抗小鼠异硫氰酸荧光素(FITC)-免疫球蛋白G(IgG)购自武汉博士德公司;Trizol试剂、引物Notch 1和β-actin均购自上海生工公司;M-MuLV逆转录酶试剂盒购自美国Fermentas公司;定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒SYBR Green Ⅰ kit购自瑞士罗氏公司;OLYMPUS IX71O倒置相差荧光显微镜与OLYMPUS CKX41倒置显微镜均购自日本HITACHI公司;LightCycler PCR 2.0系统购自瑞士罗氏公司。

1.2 方法

1.2.1大鼠DFC原代培养

取出生后6～7 d的SD大鼠的乳鼠，无菌条件下将下颌骨切除放置于磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution，PBS)中。体视显微镜下用显微镊分离下颌第一磨牙的牙胚，机械分离牙囊组织，放置于含1 %双抗的α-MEM培养液中，用眼科剪彻底剪碎。37 ℃、放置在60 U/mL Ⅰ型胶原酶中消化60 min。加入4 mL细胞培养液(α-MEM+10%胎牛血清+100 U/mL青霉素+100 μg/mL链霉素+100 mg/mL抗坏血酸)，并将大鼠DFC转移至T-25细胞培养瓶中，放置在37 ℃、5%二氧化碳培养箱中12 h让细胞贴壁。细胞融合后用0.25%胰酶消化传代。取第3代大鼠DFC作为实验细胞。实验过程中所有动物实验操作符合海南医学院伦理及操作要求。

1.2.2大鼠DFC来源的鉴定(Vimentin、CK-14细胞免疫荧光染色)

1.2.2.1细胞爬片的制作

取第3代对数生长期大鼠DFC消化制备成细胞悬液1×105/mL;,加入6孔细胞培养板中1×105个/孔，制作成爬片。

1.2.2.2细胞固定

待爬片上的细胞长至50%～60%，用4%多聚甲醛固定10 min。用1%Triton溶液配制的3%BSA封闭液中封闭作用30 min(37 ℃湿盒中)。

1.2.2.3孵育一抗

用1% BSA溶液按抗体说明书所示比例稀释抗体，Vimentin(1∶250)、 CK-14(1∶100)，37 ℃湿盒中孵育2 h。

1.2.2.4孵育二抗

用1%BSA溶液按1∶200比例稀释FITC结合的羊抗鼠IgG二抗，37 ℃湿盒中孵育1 h。

1.2.2.5细胞核染色

每张爬片滴加200 μL的DAPI(1 μg/mL)溶液浸染2 min，双蒸水洗2次，每次3 min。中性树胶封片。

1.2.3成骨分化诱导

对照组继续用基础培养液培养，成骨诱导组加入地塞米松为基础的成骨诱导液继续培养21 d，3 d换1次诱导液，镜下观察出现不规则结节即可。弃成骨诱导液，PBS洗3遍，4%多聚甲醛固定30 min，茜素红染色15 min对分化细胞进行染色，显微镜下采图。

1.2.4qRT-PCR

使用Trizol试剂分别分离对照组和成骨诱导组总RNA，采用紫外分光光度计测定RNA的量和纯度。使用M-MuLV逆转录酶试剂盒进行cDNA合成。qRT-PCR用SYBR Green Ⅰ kit和LightCycler PCR 2.0系统及LightCycler4.05软件计算域值循环数。引物的设计和合成由上海生工公司完成，序列见表1。以β-actin为内参照，qRT-PCR检测Notch1基因表达。反应结束后由软件分析扩增曲线和产物溶解曲线，按相对定量法自动计算目的基因mRNA拷贝数。

表1 Notch 1与β-actin引物序列

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，计数资料以例数或率表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠DFC的分离、鉴定及成骨分化潜能

大鼠DFC的原代培养3 d左右细胞从组织块周围爬出，见图1A。DFC大部分呈纺锤状、长梭形，少部分为多角形，其来源于外胚层间充质，具有典型的间充质成纤维细胞形态，见图1B。CK-14染色为阴性，见图1C。Vimentin几乎表达于所有大鼠DFC，染色阳性，见图1D。表明获取的DFC是间充质干细胞，而无上皮细胞。混杂在大鼠DFC原代中的上皮细胞传至第3代时大鼠DFC已基本被纯化。用含有地塞米松的成骨诱导液诱导大鼠DFC 28 d后用茜素红染色液染色可见许多红色矿化小结节生成，见图1E。

A：组织块原代培养DFC；B：第3代DFC；C：CK-14抗体免疫荧光检测；D：Vimentin抗体免疫荧光检测；E：第3代DFC成骨诱导后茜素红染色。图1 大鼠DFC的分离、鉴定及成骨分化潜能

2.2 经成骨诱导后DFC的Notch 1 信号表达情况

与对照组比较，成骨诱导28 d后DFC的Notch 1基因表达下降，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

*：P<0.05，与对照组比较。图2 经成骨诱导后DFC的Notch 1 信号表达情况

3 讨 论

DFC作为骨组织工程的种子细胞之一，具有取材方便、多向分化能力强等优点，在骨修复研究中具有良好的应用前景[5]。牙囊是包绕于牙齿发育期成釉器和牙乳头周围的疏松结缔组织，来源于外胚层间充质，在牙齿萌出和牙周组织形成中具有重要作用。DFC是成骨细胞和成牙骨质细胞的前体细胞，DFC中有碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨钙蛋白、骨涎蛋白等成骨细胞标志物表达，有牙骨质附着蛋白等成牙骨质细胞标志物表达，经诱导分化可形成牙槽骨和牙骨质[6]。DFC与上皮根鞘细胞和牙髓细胞混合，可以诱导DFC成骨及成牙骨质方向分化，形成骨样组织和成牙骨质组织[7]。本研究成功分离、培养、鉴定了DFC。DFC的鉴定包括细胞形态鉴定和细胞表面特异性标志物检测。DFC大多为呈梭形的成纤维细胞样,呈纺锤状结构，漩涡状排列，贴壁生长。DFC来源于外胚间充质，可检测到间充质干细胞表面标志物——Vimentin染色阳性，同时上皮细胞表面标志物——CK-14染色阴性。利用茜素红染色液对经成骨诱导的DFC进行染色可见若干红色矿化小结节生成，表明DFC在合适的成骨诱导条件下可以向成骨分化，与相关研究结果一致[8]。

Notch信号通路广泛存在于脊椎动物和非脊椎动物，在进化上高度保守，通过相邻细胞之间的相互作用调节细胞、组织、器官的分化和发育[9]。相邻细胞可以通过Notch受体与配体的结合传递Notch信号。Notch信号是相邻细胞之间通讯进而调控细胞发育分化的重要通路[10-11]。Notch 1作为Notch信号通路的主要受体，与其配体——Jagged 1及下游靶基因——Hes 1均为调控细胞分化的关键信号通路因子。在胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠模型中，CIA组大鼠关节Notch 1呈强阳性表达，同时Jagged 1、Hes 1表达也显著上升，高于对照组和中药(傅山风湿外治方)控制组，差异均有统计学意义(P<0.05)，说明Notch 1/Jagged 1信号通路在诱发CIA的过程中得到激活，参与了CIA的发生、发展。通过药物控制能显著降低Notch 1、Jagged 1、Hes 1的表达，抑制CIA大鼠中Notch 1/Jagged 1信号通路的活化[12]。表明Notch 1与配体Jagged 1结合后能影响其下游靶基因Hes 1的转录，Notch 1的表达水平能影响Notch 1/Jagged 1信号通路的激活或抑制，从而调控多种炎症因子的表达，如白细胞介素-6、γ干扰素等，发挥炎症调控作用[13]。

Notch 1 是DFC维持未分化状态的标记物之一，成骨分化过程中Notch信号在DFC中被激活[14]。Notch信号通路被激活不仅影响DFC成骨分化，而且影响BMP/DLX3信号通路(成骨分化相关通路)的激活，Notch信号通路可能通过负反馈回路调节DFC的成骨分化[15]。有研究发现，抑制Notch信号通路后可抑制骨肉瘤细胞MG63成骨分化，联合调控Notch信号通路与分化抑制因子1靶基因的表达可遏制骨肉瘤异常成骨分化，诱导其向正常成骨分化，促使异常中断的成骨分化重新发生[16]，说明Notch信号在骨肉瘤细胞MG63成骨分化中具有重要作用。有研究将人牙周膜干细胞经成骨诱导分化后发现，整合素金属蛋白酶10(ADAM10)过表达组矿化结节形成量、成骨相关基因ALP、Runx2、OCN mRNA表达水平及Notch信号通路相关基因——Notch1、NICD、Hes mRNA和蛋白表达水平均显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，表明过表达ADAM10可促进人牙周膜干细胞增殖并抑制其成骨分化，其机制可能与Notch信号通路的激活有关[17]。在骨质疏松症大鼠动物模型中，经成骨诱导后骨质疏松症脂肪干细胞形成的矿化结节数量、Runx2、Notch1表达水平均比正常脂肪干细胞低，说明骨质疏松症脂肪干细胞成骨能力比正常脂肪干细胞弱，且Notch信号通路受到抑制[18]。本研究结果显示，与对照组比较，DFC经28 d成骨诱导后Notch 1基因表达下降，表明在成骨诱导环境下Notch信号通过下调影响DFC向成骨方向分化，与相关研究结果一致。然而Notch信号通路的各级信号因子如何相互作用精确调控DFC的成骨分化仍需进一步研究。

综上所述，DFC表达间充质干细胞表面标志物和Notch信号，具有间充质干细胞的特性。在成骨分化过程中Notch信号表达量下调，通过负反馈回路调节DFC的成骨分化。