柳成东 肖俊峰 肖丽萍 王丽娜 邵金龙 吴有林 丁能水,4*

（1福建傲农生物科技集团股份有限公司，福建漳州 363000；2福建傲农生物科技集团股份有限公司/福建省生猪营养与饲料重点实验室，福建漳州 363000；3厦门市同安区农业农村局农村经济发展中心，福建厦门 361100；4江西农业大学猪遗传改良与养殖技术国家重点实验室，江西南昌 330045）

目前，随着我国禁止在饲料中使用促生长药物添加剂的养殖现状，开发新型饲料添加剂成为了亟待解决和研究的话题[1,2]。凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌作为我国农业农村部规范的饲用益生菌（《饲料添加剂品种目录》，2013）往往以单一菌或组合菌的方式运用在饲料和畜禽养殖中[2]。有大量研究表明[3-7]，饲粮中添加凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌能够显著改善断奶仔猪的生长性能。很少有研究表明，凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌组合在断奶仔猪上的运用效果；其中，王志祥等[8]和王乙茹等[9]的研究显示，在断奶仔猪饲粮中同时添加凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌后，仔猪的生长性能表现出更好的饲喂效果。针对这一试验结果，本研究从凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌组合比例方面存在的问题展开研究，以期为后期养猪生产中凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的联合应用提供理论依据。

通过体外评估饲用益生菌的效果，可以提高益生菌在动物饲养试验上的运用效果和研发效率[10]。同时，牛津杯法是体外评估益生菌抑菌性能常用的评估方法，根据抑菌圈的大小来判定其抑菌效果[11,12]。据此，本研究前期采用牛津杯法评估凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌不同比例之间的抑菌效果来选择最佳的在饲粮中的添加比例，为饲用益生菌组合运用评估提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

凝结芽孢杆菌（总菌数：1×1010CFU/g）由昆明三正生物科技（集团）有限公司提供；枯草芽孢杆菌（总菌数：1×1010CFU/g）由广东珠海建明工业有限公司提供。

产肠毒素大肠杆菌K88（Enterotoxigenic Escherichia coli K88CGMCC1.2385）购买于北纳生物科技有限公司。

1.2 抑菌试验

试验采用牛津杯法，将凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌计数后，挑取单一菌落进行活菌培养24 h，按菌液体积1∶1、2∶1、5∶1和10∶1的比例接种到培养液中，混合培养24 h后完成对大肠杆菌K88的抑菌试验，按照最佳的抑菌效果体积比例，来确定凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌在饲料中的添加比例和添加量，进而开展动物饲养试验。

1.3 试验设计

按体重一致原则将54头25日龄健康的断奶仔猪，分为2个处理组。每个处理组3个重复，每个重复（单栏）9头断奶仔猪。对照组饲喂基础日粮，试验组在基础日粮中添加凝结芽孢杆菌800 g/t＋枯草芽孢杆菌400 g/t。

1.4 试验饲粮

试验饲粮配方参照NRC（2012）猪营养需要量标准配制基础饲粮，配方组成及营养水平见表1，基础饲粮中不添加任何促生长药物饲料添加剂及其他饲用益生菌。

表1 基础日粮组成及营养水平

1.5 饲养管理

试验在福建省三明市清流养宝生态农业有限公司猪场完成。试验猪单栏饲养，产房温度保持24～27℃。试验全程自由采食和饮水，24 h光照。饲养试验周期7 d。

1.6 测定指标

1.6.1 生长性能

以每栏为单位统计断奶仔猪平均日增重、平均日采食量及料肉比和腹泻率，腹泻率参照浦俊宁等[10]。

腹泻率（%）＝[试验期间每栏腹泻头数÷（试验期间每栏仔猪总数×试验天数）]×100%

1.6.2 肠道菌群测定

屠宰后，用无菌EP管采集猪盲肠食糜，放置于液氮速冻，放-80℃冰箱保存备用，采用平板计数法测定盲肠中大肠杆菌和乳酸杆菌数量[12]。

1.7 统计分析

生长性能、肠道菌群等数据采用T-test进行数据分析，抑菌圈数据采用单因素方差分析和Duncan's多重比较。采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析。P≤0.05表示显著差异，0.05＜P≤0.1表示有差异的趋势。

2 结果与分析

2.1 凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌对大肠杆菌K88抑菌效果的评估

由表2可知，凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌对大肠杆菌K88的抑菌作用无明显差异（P＞0.05）。同时，凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌不同比例抑菌作用之间有明显差异（P＜0.05）；且当凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌2∶1的组合时，对大肠杆菌K88的抑菌效果最佳。

表2 凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌组合对大肠杆菌K88的抑菌圈直径 （mm）

2.2 凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌组合对断奶仔猪生产性能的影响

由表3可知，日粮中添加凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌能够显著降低仔猪的料肉比和腹泻率（P＜0.05）；但对仔猪的末重和平均日采食量无影响（P＞0.05）；对断奶仔猪增重有增加的趋势（0.05＜P≤0.1）。

表3 凝结芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌组合对断奶仔猪生长性能的影响

2.3 凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌组合对断奶仔猪肠道菌群的影响

由表4可知，与对照组相比，日粮中添加凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌能够显著降低仔猪盲肠中大肠杆菌的数量（P＜0.05）；显著增加仔猪盲肠中乳酸杆菌的数量（P＜0.05）。

表4 凝结芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌组合对断奶仔猪肠道菌群的影响 （log10CFU/g）

3 讨论

3.1 凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌组合抑菌性能的实验评估

大肠杆菌K88是引起断奶仔猪腹泻的主要肠道致病菌，往往断奶仔猪腹泻情况在断奶后7 d左右较为严重[13-16]，这也是试验周期采用7 d的科学依据。试验结果显示，与单一的凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌对大肠杆菌K88的抑菌效果相比；不同组合比例之间对大肠杆菌K88对的抑菌效果差异显著，这也是凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌组合后，在断奶仔猪上未取得效果可能的原因[8,9]。这也提示，饲用益生菌组合运用，应慎重考虑复配菌种、菌群之间的比例。

3.2 凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌组合对断奶仔猪生长性能的影响

已有研究显示[3-7]，饲粮中单一添加凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌能够显著改善断奶仔猪的生长性能。本研究显示，当凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌按2∶1的添加剂量组合时，能够显著改善断奶仔猪饲料转换率和腹泻情况，这一结果也与体外牛津杯抑菌试验结果一致（表2）。该结果表明，体外实验的评估结果一定程度可以体现体内动物饲养试验的饲喂效果。

3.3 凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌组合对断奶仔猪肠道菌群的影响

肠道菌群的发育和平衡对断奶仔猪的肠道健康有着重要的作用，肠道中的乳酸杆菌和大肠杆菌的存在形成了维持肠道健康的2个主要细菌[17-19]。本试验结果显示，饲粮中同时添加凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌能够显著降低断奶仔猪肠道中大肠杆菌的数量，增加肠道中乳酸杆菌的数量。这也是在饲粮中添加凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌后，能够改善断奶仔猪生长性能的重要因素之一（表 3）。

4 结论

本研究从体外牛津杯试验到体内动物饲养试验，从2个方面同时验证了凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌组合在饲粮中能够平衡肠道菌群，改善断奶仔猪的生长性能。一方面充分说明在体外评估益生菌的抑菌效果的基础上，进行动物饲养试验是可以作为初步的评估依据；另一方面，这也为凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌能够作为益生菌复配在饲料添加剂中运用提供科学依据。