罗远华， 方能炎， 樊荣辉， 黄敏玲

(福建省农业科学院作物研究所/福建省农业科学院花卉研究中心/福建省特色花卉工程技术研究中心，福建福州 350013)

兰科(Orchidaceae)植物是开花植物中仅次于菊科(Asteraceae)的第二大科，目前已确认的有736属28 000种，广泛分布于除两极和干旱沙漠地区以外的区域，主要生长于热带和亚热带地区。兰科植物不仅具有极高的观赏价值，不少种类如铁皮石斛()、金线莲()等也具有较高的药用价值。

多倍体是指体细胞中含有3个或者3个以上完整染色体组的生物体，多倍体现象在高等植物中普遍存在，是驱动植物进化和物种形成的主要动力之一。多倍体育种手段比较简单，育出的品种不仅在表型性状、次生代谢物的积累以及抗逆性等方面具有较多的优点，而且还能有效克服远缘杂交不亲和等特点，因此应用较为广泛。多倍体现象在兰科植物中普遍存在，但自然加倍的发生频率低，难以满足生产实践。近年来，国内外在兰科植物多倍化研究方面较为深入和广泛。到目前为止，已开展了兰科植物中至少16个属的人工诱导多倍体研究(表1)，部分诱导获得的多倍体已在生产中得到应用。本文主要总结了近20年来兰科植物多倍体诱导的研究进展，旨在为兰科植物多倍体育种提供参考。

表1 2000—2020年已诱导获得多倍体的主要兰科植物

1 兰科植物多倍体诱导

1.1 诱变材料的选择

兰科植物同其他植物一样，在诱导多倍体时应选择分裂旺盛的组织作为诱变材料，主要有种子、胚状体、原球茎、类原球茎、根状茎、茎尖、不定芽、丛生芽、带节茎段等(表2)。诱变材料在很大程度上决定了诱变的效率，因此须要根据种类的不同选择适宜的诱变材料。相同材料由于诱变材料的差异也会影响诱导率，筛选适宜的诱变材料是成功获得多倍体的基础。以秋水仙素(colchicine)为诱导剂进行浸泡处理诱导铁皮石斛()多倍体研究时，张静静分别以种胚、类原球茎、带节茎段为材料，诱导率分别为40.0%、40.0%、30.0%；吴睿以原球茎和丛生芽为材料，再生植株多倍体诱导率分别为16.7%、13.3%；张青华等以类原球茎、丛生芽为材料，诱导率分别为26.0%、48.0%。

表2 兰科植物多倍体诱导研究进展

表2(续)

1.2 诱变剂种类的选择

多倍体化学诱导的原理是利用抗微管药物与分裂细胞的微管蛋白结合，迫使细胞有丝分裂中断，使姐妹染色单体不能移向细胞两级，从而产生染色体组数加倍的细胞。在兰科植物多倍体诱导中，秋水仙素的应用最为广泛(表2)。但秋水仙素诱导染色体加倍时需要较高的浓度，因此对植物材料的伤害较大，且价格较昂贵，因此育种专家们一直在尝试使用其他诱变剂。

安磺灵、二甲戊灵、甲基胺草磷等与秋水仙素的作用机制一致，这些药剂甚至对植物微管蛋白的亲和性更高，在兰科植物中应用越来越广泛。Hwang等比较了秋水仙素和安磺灵对大花蕙兰的诱导效果，采用0.05 g/L秋水仙素浸泡处理7 d，诱导率为60.0%；采用0.005 g/L秋水仙素浸泡处理 14 d，诱导率为46.7%。Chung等也比较了秋水仙素和安磺灵对虾脊兰杂交F种子的诱导效果，采用0.10 g/L秋水仙素浸泡处理7 d，诱导率为81.0%；采用0.03 g/L安磺灵浸泡处理1 d的诱导率为86.0%。滕人达比较了秋水仙素和二甲戊灵对金线莲的诱导效果，采用0.09 g/L二甲戊灵浸泡处理48 h，存活率为56.7%，诱导率为50.0%；而采用0.70 g/L秋水仙素浸泡处理24 h，存活率为50.0%，诱导率为43.3%，二甲戊灵使用浓度较低，但诱导效率优于秋水仙素。除使用一种诱变剂外，还可以混用2种诱变剂诱导多倍体。李秀兰等采用附加了0.1 g/L 秋水仙素与0.005 g/L安磺灵的培养基诱导培养8～10 d，秋石斛四倍体诱导率达到90%以上。

1.3 处理方法、诱变剂浓度与时间

1.3.1 处理方法 兰科植物多倍体诱导方法有浸泡法、混培法和涂抹法等，其中以浸泡法和混培法应用较多(表2)。浸泡法能使诱变剂充分接触诱变材料，能减少嵌合体的发生，但对材料伤害较大，处理时间不宜过长。混培法是将诱变材料接种到添加了诱变剂的培养基中，培养一段时间后转移到常规培养基中。混培法中诱变剂浓度一般较小，对材料伤害较小，但处理时间一般较长。何碧珠等研究了不同处理方法对金线莲多倍体的诱导效果，结果表明混培法最优，浸泡法次之，涂抹法较差。卓孝康也比较了不同处理方法对大苞鞘石斛多倍体的诱导效果，1.0 g/L秋水仙素浸泡处理12 h的诱导率为26.0%，而采用0.3 g/L秋水仙素混培处理30 d的诱导率达34.0%，但认为混培法中诱变剂使用浓度虽低，但较浸泡法处理的时间更长，经多代培养后的植株生长性状仍表现出明显的毒副作用，这与夏春英的研究结果一致。

1.3.2 诱变剂浓度与处理时间 研究表明，当处理时间一定时，诱变材料的死亡率随诱变剂浓度的升高呈不断增加的变化趋势；当诱变剂浓度一定时，随处理时间的延长诱变材料的死亡率也不断上升。适宜的诱变剂浓度及处理时间是兰科植物多倍体成功诱导的关键。兰科植物多倍体诱导中，秋水仙素使用的最低浓度为0.000 6 g/L，最高使用浓度为30.000 0 g/L，使用较多的浓度范围在0.05～2.00 g/L之间；安磺灵使用的适宜浓度范围比较集中，主要在0.005～0.030 g/L之间；二甲戊灵和甲基胺草磷应用较少，适宜浓度分别为0.05～0.09 g/L 和0.01 g/L。秋水仙素浸泡法处理的最短时间是30 min，最长时间是 13 d，使用较多的时间范围在12 h至7 d；秋水仙素混培法处理的时间范围是3～120 d。安磺灵处理的时间范围是48 h至14 d，二甲戊灵处理的时间范围是48 h至 8 d，甲基胺草磷处理的时间范围是12～48 h。因此，在实际应用中，应设置适宜的诱变剂浓度梯度和处理时间梯度，并结合诱变材料的死亡率、多倍体诱导率以及生长情况，探索适宜不同品种的最佳组合。

2 兰科植物多倍体鉴定

2.1 形态学鉴定

株高、茎粗、节间长、叶长、叶宽、叶色、根粗、叶脉等可作为鉴别兰科植物多倍体的重要形态指标。研究表明，兰属植物诱导获得的多倍体，植株矮壮，叶片变厚、变宽，叶长、叶形指数变小，叶色深绿，但叶片易扭曲、畸形，生长缓慢；石斛属植物诱导获得的多倍体植株多矮壮，节间短、叶片加厚、叶色深绿，但叶片易折断，生长缓慢；开唇兰属植物多倍体植株更高大，茎段粗壮、节间加长、叶片变大、叶片肥厚、叶色深、根粗壮，但生长缓慢。

2.2 细胞学鉴定

兰科植物多倍体植株的气孔和保卫细胞变大，单位叶面积气孔数减少，保卫细胞内叶绿体大且颜色较深，保卫细胞中叶绿体数增多，叶绿素含量明显增加。气孔密度、气孔和保卫细胞的大小及保卫细胞内叶绿体大小与数量等可作为鉴别兰科植物二倍体和多倍体的重要指标。

2.3 染色体计数鉴定

染色体计数是最直接、最有效的植物倍性鉴定方法。兰科植物多倍体染色体数量鉴定中，主要以根尖为材料进行常规压片法鉴定，但在对金线莲的倍性鉴定时，赖红英等以茎尖为材料，鉴定出了多倍体植株的染色体数量。染色体计数法虽然方法步骤较简单，但对操作技术具有较高的要求。

2.4 流式细胞术鉴定

流式细胞术(flow cytometry)是20世纪70年代发展起来的用于快速测定细胞核内DNA含量和细胞核大小的技术，是现代生物学、医学常用的细胞分选技术。目前，流式细胞术在兰科植物基因组大小测定、染色体倍性鉴定和内多倍性研究等方面得到广泛应用。目前，利用流式细胞术在兰属、石斛属、开唇兰属、新堇兰属、兜兰属、蝴蝶兰属、虾脊兰属、白芨属、文心兰属、苞舌兰属等兰科植物的人工多倍体诱导鉴定中得到广泛应用，同时也应用于手参属()、掌裂兰属()等兰科植物的多倍体进化研究中。

3 兰科植物多倍体诱导的意义

3.1 提高观赏性

多倍体植物的表型通常具有巨大性，因此有望通过多倍体育种培育出花朵更大、花瓣变多、花色变深、花质厚重的兰花新品种。同时多倍体还具有植株粗壮、叶片宽厚、叶色浓绿等特征，从而调节株型，提高整体观赏价值。廖道龙等研究表明，随着倍性的增加，石斛属植物的叶片呈增长、增宽、增厚，花朵直径呈增大、花瓣增厚的趋势，茎粗呈增大的变化趋势，其中四倍体的花朵直径、茎粗显著大于二倍体和三倍体。谢利等研究表明，随着倍性的增加，蝴蝶兰花朵直径逐渐增大，四倍体的花朵直径显著大于三倍体和二倍体，但花朵数量显著少于二倍体和三倍体，三倍体花朵数量最多。

3.2 克服远缘杂交障碍

在杂交之前先使某一亲本加倍成同源多倍体，可克服杂交不亲和，提高杂交结实率。远缘杂种F，在减数分裂过程中大量的单价体会导致严重的不育，通过染色体加倍后获得的异源多倍体可恢复生育能力。多倍体的近亲繁殖抑制程度也低于二倍体亲本，因此能够容忍更高水平的自交。人工诱变获得的多倍体类型一般仅能作为育种中间材料，在进一步进行杂交、回交等利用时，还需保持和提高目标性状才可能选育出商业品种。值得一提的是，如获得的兰科植物多倍体具有良好的商品性，则可通过无性繁殖的途径快速固定并繁殖，直接进行市场化应用。

3.3 提高抗逆性

同源多倍体降低了突变和隐性基因纯合表现可能性以及异源多倍体中等位基因杂合性，利于其内部环境的稳定，能提高遗传多样性和适应能力，因此多倍体对不良环境具有更强的抵抗力，具有强大的生长优势和良好的开发利用前景。陈晓梅研究认为，蕙兰叶绿素含量随倍性的增加而增加，相较于二倍体，四倍体蕙兰植株的耐寒性和抗旱性均提高。吴姝漪研究表明，高温胁迫下四倍体华石斛较二倍体的叶绿素含量(SPAD值)和相对电导率变化都更平缓，且四倍体出现高温胁迫的时间更晚，推断出四倍体华石斛的耐热性更强。周珊珊等研究表明，大花蕙兰多倍体类原球茎抵御低温和高温能力强于二倍体，多倍体中抗氧化酶系(SOD、POD、CAT)活性及丙二醛含量的变化是导致多倍体抗性增强的重要原因。王园园研究表明，高温胁迫下四倍体杂交兰叶绿素含量的降幅小于二倍体，丙二醛含量及增幅也小于二倍体，而脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量的增幅均大于二倍体，研究证明四倍体较二倍体具有更强的抗逆性。

3.4 提高次生代谢物含量

铁皮石斛、金线莲等兰科药用植物的功效成分主要为糖类、茋类、酚类、萜类、生物碱类、黄酮类和甾醇类等，其中主要由甘露糖和葡萄糖等单糖构成的水溶性多糖是其重要活性成分之一。兰科植物加倍后往往能提高其体内能源物质与活性成分的含量。研究表明，铁皮石斛同源四倍体中叶绿素、可溶性糖、可溶性蛋白、多糖的含量显著高于二倍体。多倍体金线莲的多糖、总黄酮含量均高于二倍体植株。霍山石斛四倍体的根、茎、叶中多糖、生物碱的含量均高于二倍体，二倍体和四倍体中参与多糖、萜类、聚酮类、氨基酸等代谢及激素合成与信号转导的关键基因的差异表达，可能是四倍体植株体内能源物质含量增加、活性成分提高和生长势增强的主要原因。此外，王园园比较鉴定了二倍体、四倍体杂交兰的生理指标，发现四倍体植株中可溶性糖和蛋白质含量均显著高于二倍体。

4 主要问题与展望

4.1 嵌合体的分离

多倍体诱导中无论采用何种材料与诱变方法，常伴有大量的嵌合体。诱变获得的嵌合体植株不能稳定遗传，因此需要对嵌合体进行鉴定、分离与纯化。一直以来，兰科植物嵌合体的分离与纯化极其困难。随着组织培养与多倍体育种技术的有机结合，多倍体诱导中的嵌合体问题正逐步得到解决。准确地掌握适宜不同材料的诱变剂浓度、处理时间和处理方法，在提高多倍体诱变效率的同时，采用有效的嵌合体分离方法是成功获得多倍体的关键。组织连续切割分离法是嵌合体分离常用的方法之一。李涵等采用不定芽结合组织培养技术，多倍体诱导后通过不断切割、培养产生新的个体，成功获得了部分稳定的多倍体植株材料。孙红梅等研究表明，以体细胞胚发生体系进行多倍体诱导可有效减少嵌合体形成。对于兰科植物而言，以种子诱导出的原胚期原球茎、种胚或体细胞胚胎发生获得的胚状体、类原球茎等都是处于尚未分化的母细胞阶段，进行多倍体诱导时一旦加倍成功后将发育成多倍体原球茎或类原球茎，进一步再分化便可获得大量多倍体幼苗，能提高多倍体纯合体的选择效率。

4.2 多倍体的繁殖

多倍体植株通常生长发育缓慢。尹翠翠等研究表明，加倍后的杂交兰虽然生长缓慢，但通过调节培养基营养组成及生长调节剂的浓度，获得了正常生长的四倍体无菌苗。吴姝漪研究表明，华石斛四倍体与二倍体具有相同的增殖效果，且增殖后的四倍体幼苗生长健壮。刘静雯等系统研究并建立了铁皮石斛同源四倍体工厂化快繁工艺；李丹丹研究筛选出了适宜铁皮石斛同源四倍体的栽培基质配方，为铁皮石斛同源四倍体种质的生产推广提供了技术支撑。总体而言，针对兰科植物多倍体繁育的研究还不够深入，系统研究并建立适宜的繁殖技术体系是提高多倍体利用效率的重要环节。