唐 敏，刘 刚，2*，王雪力，汪淑芳，2，赵甲元，2，陈晓凤，刘兴艳

（1.四川师范大学 生命科学学院，四川 成都 610101；2.四川师范大学 食品功能及加工应用研究所，四川 成都 610101；3.四川师范大学 化学与材料科学学院，四川 成都 610066）

桑葚是桑属植物桑树（Morus alba L.）的果实，为聚花果，俗称桑椹、桑乌、桑枣等［1］.桑葚中水分质量分数约为85%［2］，酸甜可口，卡路里含量比较低，而且含有多种人体必需的氨基酸、维生素、纤维素、矿物质和果胶等营养成分，具有极高的营养价值［3-4］.此外，大量研究表明，桑葚中富含多酚、黄酮、多糖等多种功能性成分［5-6］.据《中国药典》记载，桑葚具有滋阴补血、生津润燥的功能［7］.1993 年桑葚因其具有的食药用价值，被列入“既是食品又是中药材”的物质目录.

新鲜桑葚含水量高、果皮薄、果实柔软，采摘后极易发生腐烂和霉变，储存和运输成本较髙［8］.因此，桑葚大多被加工制作成桑葚果汁、桑葚果酱［9］、桑葚果干等产品.近年来，随着生物发酵技术的发展，桑葚果酒、果醋、酵素等产品逐渐被开发出来.桑葚酵素是利用桑葚的特征成分和菌种的发酵转化作用生产的具有一定保健功能的新型保健食品［10］.

酵素由日语的“酶”翻译而来，是日本对酶的别称［11］.现在市面上的酵素多指包含酶和其他生物活性物质的混合物.据已有研究，酵素有抗氧化［12］、抑菌［13］、降血脂［14］、润肠通便［15］、保护酒精性肝损伤、改善胃肠功能和平衡机体等作用［16-17］，倍受消费者青睐，具有广阔的发展前景和很大的开发价值.

本研究以桑葚为原材料，采用自然发酵与复合发酵2 种不同的发酵工艺对桑葚进行发酵，制备桑葚酵素；并从感官评价、发酵过程中质量变化等方面比较2 种发酵工艺制得的桑葚酵素，为桑葚产品的综合开发利用提供理论参考.

1 材料与方法

1.1 材料桑葚产于四川省德昌县，酸奶发酵剂（含嗜热链球菌、长双歧杆菌、保加利亚乳杆菌等乳酸菌）由安琪酵母股份有限公司提拱.

1.2 仪器与设备YB-250 高速多功能粉碎机（永康市速锋工贸有限公司）、SJ-CJ-2FDQ 超净工作台（江苏苏洁净化设备厂）、LRH-800F 生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）和LDZH-150KBS立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）等.

1.3 桑葚酵素的制备制备工艺参考专利文献［18］并略做改进.桑葚去梗，无菌水清洗2次，沥干水分，粉碎，得桑葚浆液.将桑葚浆液∶白砂糖∶无菌水按4 ∶1∶1的质量比混合，置于无菌发酵罐，低速搅拌30 min，然后复合发酵组加入体积分数1%酸奶发酵剂，自然发酵组不添加，均置于35 ℃进行恒温发酵.

1.4 桑葚酵素功效成分的测定发酵期间每日定时取样、抽滤，对滤液进行测定.利用已校准的pH计测定样品pH值.多糖含量的测定参考Wu 等［19］的苯酚-硫酸法，以葡萄糖为标准品，得标准曲线，回归方程为

多酚含量的测定参考Lachman等［20］采用的福林酚法，以没食子酸为标准品，得标准曲线，回归方程为

黄酮含量的测定参考范艳丽等［21］采用的硝酸铝显色法，以没食子酸为标准品，得标准曲线，回归方程为

1.5 桑葚酵素的感官评价参考文献［22-23］的感官评定标准，对不同工艺制得的桑葚酵素进行感官分值评定，评分标准见表1.取10 名试验人员，按感官评价标准，对桑葚酵素进行评分.

表1 感官评分表Tab.1 Sensory score table

1.6 桑葚酵素的抗氧化活性

1.6.1DPPH测定法 取2 支试管，向其中一支试管加入2 mL DPPH溶液与1 mL酵素样品液，另一支试管中加入2 mL DPPH 溶液与1 mL 体积分数95%乙醇，摇匀，室温下避光放置30 min，于波长517 nm处测定吸光度值，以体积分数95%乙醇溶液作为空白对照，多次重复测定取平均值［24］.DPPH自由基清除率计算公式为

其中，As为DPPH溶液+1 mL样品的吸光度，A0为DPPH溶液+1 mL体积分数95%乙醇的吸光度.

1.6.2ABTS 测定法 准确称取ABTS 3 mg，加0.735 mL蒸馏水配制成7.4 mol／L的ABTS 储备液.准确称取1 mg K2S2O8，加蒸馏水1.43 mL，得2.6 mmol／L K2S2O8储备液.分别吸取ABTS·储备液和K2S2O8储备液各0.5 mL，混合均匀，于黑暗条件室温放置12 h.使用体积分数95%乙醇对混合储备液进行稀释，稀释到A734nm＝0.7±0.02.取2 mL稀释液与0.5 mL酵素样品液混合，室温放置6 min，于波长734 nm处测定吸光值.以体积分数95%乙醇溶液作为空白对照，多次重复测定取平均值［25］.ABTS自由基清除率的计算公式为

其中，As为2 mL ABTS·溶液+0.5 mL 酵素稀释液的吸光度，A0为2 mL ABTS·溶液+0.5 mL 体积分数95%乙醇的吸光度.

1.7 实验数据处理与分析本试验均设有至少3组平行，所有的实验数据均用平均值±标准差（Means ± std）表示.采用SPSS 21.0 中的ANOVA、Duncan检验对数据进行分析.统计结果用Graph Pad Prism 5 和Origin 8.5 软件来绘制图表.

2 结果与分析

2.1 发酵制备方式对桑葚酵素质量指标的影响

2.1.1发酵制备方式对桑葚酵素pH 值的影响测定 发酵期间桑葚酵素的pH结果如图1所示.2种桑葚酵素的pH变化，均呈先下降再上升的趋势，在第5天时均降到最低值，然后再上升.与自然发酵的桑葚酵素比较，复合发酵的桑葚酵素pH值变化幅度相对较小，在第6～10 天的变化趋势更加稳定.发酵过程中pH值小幅度降低，可能由于酵素在发酵过程中有机酸浓度增加导致［26］；而发酵后期pH值有所升高，可能与发酵中微生物利用氨基酸或水解蛋白质有关［27］.

图1 桑葚酵素发酵期间pH值变化曲线Fig.1 pH change during the fermentation of mulberry enzymes

2.1.2发酵制备方式对桑葚酵素多糖含量的影响测定 桑葚酵素发酵期间多糖的含量，结果如图2所示.在发酵过程中，复合发酵制得的桑葚酵素多糖含量最高为422.94 mg／mL，在第4 天时达到最低值，为231.91 mg／mL；自然发酵制得的桑葚酵素多糖含量在发酵过程中最高为410.57 mg／mL，在第5 天时达到最低为219.27 mg／mL.桑葚酵素多糖含量在发酵期间，复合发酵与自然发酵变化趋势一致，在前4 天呈上升趋势，随后达到最低，然后有上升的趋势，这可能是由于在桑葚酵素发酵期间发酵液中微生物含量的变化，对多糖的利用率造成影响，进而影响多糖的含量变化.

图2 桑葚酵素发酵期间多糖含量变化曲线Fig.2 Changes in polysaccharide content during the fermentation of mulberry enzymes

2.1.3发酵制备方式对桑葚酵素多酚含量的影响测定 发酵期间多酚的含量，结果见图3.由此可知，自然发酵、复合发酵的桑葚酵素中多酚含量一直较为接近，这表明是否添加酸奶发酵剂对多酚含量影响不大.多酚含量变化都呈现先上升再下降，而后逐渐平稳的趋势，这可能与微生物对多种构型多酚的转化有关.多酚组分含量的变化，会影响酵素的抗氧化活性［28］.

图3 桑葚酵素发酵期间多酚含量变化曲线Fig.3 Changes in polyphenol content during the fermentation of mulberry enzymes

2.1.4发酵制备方式对桑葚酵素黄酮类物质含量的影响测定 发酵过程中样品黄酮类物质的含量，结果见图4.可以看出，在桑葚酵素制备期间，自然发酵的黄酮含量显著高于复合发酵的，2 种发酵方式的黄酮含量在发酵过程中均有所增加，但变化趋势基本不同，这可能是由于不同微生物对不同黄酮类物质的利用率相差较大，以及在发酵过程中不同种类的黄酮类物质相互转化导致的.

图4 桑葚酵素发酵期间黄酮含量变化曲线Fig.4 Changes in flavonoid content during the fermentation of mulberry enzymes

2.2 发酵制备方式对桑葚酵素感官评价的影响选取发酵过程中最好条件下的桑葚酵素，进行感官评价，结果见图5.复合发酵的桑葚酵素感官评分，大多高于自然发酵的桑葚酵素.在感官指标的透明澄清度、颜色均一度、杂质沉淀、状态均匀、不良异味5个方面，2 种酵素的感官评分差异极显著（P ＜0.01），其中复合发酵的评分较高.自然发酵的芳香较浓，评分高于复合发酵，差异极显著（P ＜0.01），复合发酵的酸度值显著高于自然发酵（P≤0.05）.从气味、涩口、口感持久度3方面比较，2种不同发酵工艺的桑葚酵素无明显区别，差异不显著（P ＞0.05）.本实验研究的结论，更加细化了文献［29］的酵素风味会随发酵条件变化而改变的结论.因此，本实验的结果对于桑葚酵素产品质量控制尤为重要.

图5 桑葚酵素感官评价结果Fig.5 Sensory score of mulberry enzymes

2.3 发酵制备方式对桑葚酵素体外抗氧化活性影响

2.3.1DPPH 测定法的结果 测定桑葚酵素DPPH清除率的变化，结果见图6.可以看出，发酵过程中，DPPH清除率呈下降趋势，复合发酵下降趋势较自然发酵缓慢且平缓.复合发酵的桑葚酵素最低DPPH自由基清除率显著高于自然发酵（P ≤0.05）.发酵过程中，样品清除DPPH自由基的活性逐渐减弱，这很可能与发酵中微生物消耗了清除DPPH自由基的成分有关.

图6 桑葚酵素发酵期间DPPH清除率变化曲线Fig.6 Changes in DPPH clearance during the fermentation of mulberry enzymes

2.3.2 ABTS 测定法的结果测定桑葚酵素的ABTS清除能力，结果见图7.可以看出，自然发酵、复合发酵2种发酵工艺，桑葚酵素对ABTS自由基的清除率变化趋势大致相同，都可分为2 个阶段：第一阶段呈上升趋势，复合发酵的清除率比自然发酵的提前1 d达到最大值，到最大值后的第二阶段，对ABTS自由基的清除率趋于平缓，无明显的变化.

图7 桑葚酵素发酵期间ABTS清除率变化曲线Fig.7 Changes in ABTS clearance during the fermentation of mulberry enzymes

综合分析图5、6 可以看出，复合发酵的DPPH清除率、ABTS清除率均高于自然发酵，表明复合发酵的桑葚酵素抗氧化活性高于自然发酵的桑葚酵素.桑葚酵素发酵的DPPH清除率和ABTS清除率，变化趋势不一致，这可能与发酵过程中的微生物利用的原料成分和代谢产物不同，导致DPPH、ABTS自由基清除率变化有差异.

3 结论

以桑葚为原材料，比较自然发酵与复合发酵的桑葚酵素，结果表明，pH值、多糖和多酚含量的变化趋势一致，这与2种发酵过程的相似有关，而黄酮的变化差异较大，这可能受到黄酮类物质的不稳定性影响，而且发酵中黄酮类物质的构型会发生转化.感官评价结果，复合发酵的桑葚酵素，色泽较好、溶液澄清、几乎不含杂质沉淀，整体风味明显优于自然发酵，这可能与复合发酵剂添加的乳酸菌能快速形成优势菌，可抑制霉菌等微生物的生长有关.

桑葚酵素的体外抗氧化活性变化较大，DPPH清除能力逐渐降低，复合发酵桑葚酵素的DPPH 最低，清除率明显高于自然发酵；而ABTS 清除率呈上升趋势，最低清除率均在90%以上.复合发酵的桑葚酵素的DPPH 清除率、ABTS 清除率均高于自然发酵.

本实验研究从桑葚酵素发酵过程功效成分、感官评价与抗氧化活性的变化等方面，比较了2 种发酵工艺，为桑葚的综合开发、深度利用提供了理论支持.

致谢2015 年“质量工程”项目《生物技术专业实践教学目标的整合与协调研究》、2015 年学科专业类创新创业教育课程项目《食品与药品制造检验综合应用的实践》、成都益康堂药业有限公司和北京聚仁康生物技术开发有限公司对本文给予了资助，谨此谢意.