李昕蔓，杨开宇，柳俊明，王立成，李清泉，张军

(1 河北农业大学 林学院，河北 保定 071000；2 保定市满城区苗圃场，河北 满城 072150)

苹果是蔷薇科苹果属落叶乔木，具有极高的营养价值、经济价值和观赏价值，中国苹果的产量和栽种面积均居世界第一。我国是世界苹果的起源中心，有21个苹果属植物的野生种起源于我国，栽培历史悠久[1-2]。而新疆野苹果[Malussieversii(Ledeb.) Roem]是与栽培苹果品种亲缘关系最近的野生种[3]。Richards 等的研究证明，新疆野苹果是一种第三世纪的残遗植物，是栽培苹果品种的祖先种[4]。主要分布在天山山脉西部的托里县、巩留县、霍城县、新源县、额敏县等地区[5]。新疆野苹果种质资源极其丰富，被认为是经济林树种中唯一的天然基因库，也是世界野苹果基因库的重要组成部分[6-7]。新疆野苹果适应性和抗性很强，具有抗寒、抗旱、抗病、耐虫、耐瘠薄等优良特性，并且变异丰富。由于农田的极度开发、过度放牧、病虫害、乱砍滥伐等种种原因，新疆野苹果的面积正在逐渐减少，成为了国家濒危二级保护植物。也正是由于该物种稀少以及丰富的遗传多样性，新疆野苹果成为了很多研究者关注的焦点，但是基于形态指标和生理指标对新疆野苹果无性系进行综合评价方面的研究还相对较少。

基因与环境的相互作用产生了植物的表型，而表型多样性也是植物对环境的适应性表现[8-13]。植株的表型性状易于观测和调查，能简便、直观、快速地了解植物群体的遗传多样性[14-17]。同时，植物的表型性状与育种目标和生产实际联系紧密，对种质资源群体表型多样性的分析是育种过程中的基础性工作和重要内容[18-23]。

以18个新疆野苹果无性系为试验材料，对其形态指标和生理指标进行方差分析、相关性分析、聚类分析以及主成分分析，对其进行全面的种质资源评价，为新疆野苹果种质资源的开发利用及良种选育提供一定支撑。

1 材料与方法

1.1 研究地概况

试验地位于河北省保定市满城县南韩村镇孙村保定市满城区苗圃场，地理坐标为北纬38°51′，东经115°17′。该地气候属温带大陆性季风气候，春季干旱多风、夏季炎热多雨、秋季天高气爽、冬季寒冷少雪、四季分明、光照充足、雨热同期。年平均气温12.3 ℃，极端最低温度-23.4 ℃，> 10 ℃的积温为4 340.4 ℃，日照时数2 412.7 h，无霜期196 d，全年平均降水量560 mm，年最大降水量911.7 mm，降水主要集中在7、8月份。土壤类型为沙壤土，质地比较疏松，无明显分层。土壤保水能力较弱，通透性较好，昼夜温差变化较大。

1.2 试验材料

试验所用的18个新疆野苹果无性系是2010年从新疆天山地区采集的600株新疆野苹果野生单株中筛选出来的，于第2年3月份采用枝接法嫁接在距离地面10 cm高的2 a生的海棠(Malusspectabilis)砧木上，每个无性系嫁接10株，苗木生长期间正常水肥管理。

2018年7月，每个无性系随机选择3株生长良好的单株，测定其树高、地径、东西冠幅、南北冠幅、枝下高、病虫害率、分枝角度、单叶面积、比叶重、长宽比等形态指标。

2018年7月，从每个无性系随机选取的3株树上采集10片生长良好、无病虫害、成熟、无破损的功能叶，测定其叶绿素a含量、叶绿素b含量、叶绿素总量、类胡萝卜素含量、花青素含量、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、色度参数等生理指标。

1.3 研究方法

1.3.1 新疆野苹果无性系形态指标测定 用钢卷尺测量18个新疆野苹果无性系的树高、东西冠幅、南北冠幅、枝下高等；用胸径尺测量18个新疆野苹果无性系的地径；用量角器测量18个新疆野苹果无性系的分枝角度；每个无性系随机调查100片成熟的叶片，统计有病害和虫害叶片的数量，计算病虫害率；每个无性系随机选取5片生长良好、无病虫害、成熟、无破损的功能叶，带回实验室，进行叶片扫描，然后用叶形分析软件Lamina对各叶形指标进行分析，得到各无性系的单叶面积和长宽比；用电热鼓风干燥箱在80 ℃条件下将叶片烘干至恒重，称其干重，再根据叶面积计算比叶重。以上各形态指标的测定均设3次重复。

1.3.2 新疆野苹果无性系叶片生理指标测定 18个新疆野苹果无性系叶片叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总量、类胡萝卜素的测定参照邹琦、李合生等的方法[24-25]。用电子天平称取0.1 g无病虫害、无破损、成熟的叶片，将叶片剪碎后放到10 mL的离心管中，加入10 mL 95 %的乙醇溶液，将离心管盖紧，防止挥发。室温避光放置24 h，保证叶片完全变白，用紫外可见分光光度计测定提取液在3个不同波长(470 nm、645 nm、663 nm)的吸光度值。

花青素测定是在宋岩方法的基础上略做改动[26]。称取0.1 g无病虫害、无破损、成熟的叶片，将叶片剪碎后放到10 mL的离心管中，加入10 mL 10%的稀盐酸，将离心管盖紧，室温避光放置2 h，保证叶片完全变白，用紫外可见分光光度计测定提取液在535 nm的吸光度值。

可溶性糖采用蒽酮法进行测定，试验过程及步骤参照孔祥生等的测定方法[27]。可溶性蛋白采用考马斯亮蓝G-250染色法进行测定，试验过程及步骤参考樊金娟等的测定方法[28]。叶片色度测定参照Wang的方法[29]，用色度计对叶片色度参数(L*、a*、b*)进行测定，其中，L*表示色泽明亮度(黑白)，a*表示红绿色度，b*表示黄蓝色度[57]。以上各生理指标的测定均设3次重复。

1.4 数据分析

用软件Excel和SPSS 11.5对18个新疆野苹果无性系的形态指标、生理指标等进行方差分析、显著性分析以及主成分分析。

用软件R对18个新疆野苹果无性系的形态指标、生理指标等进行相关性分析。

用软件DPS 7.05绘制18个新疆野苹果无性系的聚类图。

2 结果与分析

2.1 无性系形态和生理指标对比分析

18个新疆野苹果无性系形态指标方差分析见表1。

表1 18个新疆野苹果无性系形态指标

由表1可知，18个新疆野苹果无性系10个形态指标变异系数的变化范围为2.19%～15.91%，南北冠幅的变异系数(15.91%)最大，叶面积的变异系数(2.19%)最小。各形态指标变异系数从大到小依次为南北冠幅>病害情况>比叶重>东西冠幅>分枝角度>枝下高>树高>长宽比>地径>叶面积。

18个新疆野苹果无性系的树高在2.77～4.27 m之间，平均树高为3.48 m；地径在6.67～11.40 cm之间，平均地径为8.83 cm；东西冠幅在153.33～326.67 cm之间，平均东西冠幅为224.22 cm；南北冠幅在138.33～261.67 cm之间，平均南北冠幅为196.39 cm；枝下高在40.33～67.67 cm之间，平均枝下高为51.31 cm；病虫害率在4.33%～48.33%之间，平均病虫害率为28.50%；分枝角度在34.73°～83.00°之间，平均分枝角度为60.27°；单叶面积在140 7.05～469 1.14 cm2之间，平均叶面积为237 6.19 cm2；比叶重在0.004 8～0.010 6 cm2/g之间，平均比叶重为0.007 8 cm2/g；叶片长宽比在1.36～2.01 cm之间，平均叶片长宽比为1.78 cm。

18个新疆野苹果无性系生理指标方差分析见表2。

表2 18个新疆野苹果无性系叶片色素指标

表3 18个新疆野苹果无性系叶片色度及营养指标

由表2、表3可知，18个新疆野苹果无性系10个叶片生理指标变异系数的变化范围为2.04%～13.58%，叶绿素b的变异系数(13.58%)最大，叶面积的变异系数(2.04%)最小。各生理指标变异系数从大到小依次为叶绿素b>a*>b*>花青素>叶绿素总量>叶绿素a >类胡萝卜素>可溶性蛋白>可溶性糖>L*。

18个新疆野苹果无性系的叶绿素a含量在1.89～2.26 mg/g之间，平均叶绿素a含量为2.05 mg/g；叶绿素b含量在0.53～1.68 mg/g之间，平均叶绿素b含量为1.03 mg/g；叶绿素总量在2.70～4.05 mg/g之间，平均叶绿素总量为3.18 mg/g；类胡萝卜素含量在0.16～0.63 mg/g之间，平均类胡萝卜素含量为0.52 mg/g；花青素含量在0.54～3.76 mg/g之间，平均花青素含量为2.10 mg/g；可溶性糖含量在54.26～139.93 mg/g之间，平均可溶性糖含量为99.09 mg/g；可溶性蛋白含量在9.34～20.20 mg/g之间，平均可溶性蛋白含量为13.93 mg/g；L*值在44.54～48.32之间，平均L*值为46.45；a*值在-4.38～-2.42之间，平均a*值为-3.23；b*值在4.67～8.60之间，平均b*值为6.54。

2.2 无性系形态和生理指标相关性分析

18个新疆野苹果无性系形态指标和生理指标相关性分析见图1。

图1 18个新疆野苹果无性系各形态指标与生理指标相关性分析

对18个新疆野苹果无性系的10个形态指标和10个生理指标进行相关性分析，由图1可知，与树高呈极显著正相关关系的指标有地径、叶绿素b、叶绿素总量，相关系数分别为0.942、0.871、0.872；与地径呈极显著正相关关系的指标有树高、叶绿素b、叶绿素总量，相关系数分别为0.942、0.826、0.841；病虫害率和L*之间呈极显著正相关关系，相关系数为0.637；枝下高和b*之间存在极显著正相关关系，相关系数为0.649。

2.3 无性系形态和生理指标聚类分析

18个新疆野苹果无性系形态指标和生理指标聚类分析见图2。

由图2可知，18个新疆野苹果无性系可以被100%区分开，遗传距离的变化范围为3.230～9.075，平均遗传距离为5.089。在遗传距离6.016处，18个新疆野苹果无性系被分为5类。第1类为M1、M4等2个无性系；第2类为M5、M9、M13、M10、M18、M6、M11、M8、M15等 9个无性系；第3类为M7、M14、M17、M1等4个无性系；第4类为M2、M3等2个无性系；第5类仅有M12 1个无性系。

图2 18个新疆野苹果无性系各形态指标与生理指标聚类分析

2.4 无性系形态和生理指标主成分分析

18个新疆野苹果无性系形态指标和生理指标主成分分析见表4和表5。

表4 各主成分的特征值及贡献率

表5 各形态指标与生理指标主成分分析

表5(续)

对18个新疆野苹果无性系的10个形态指标和10个生理指标进行主成分分析(表4)，选取特征值大于1的主成分，得到5个主成分，各主成分的贡献率分别为32.910%(F1)、22.046%(F2)、13.571%(F3)、10.498%(F4)和5.165%(F5)，5个主成分的累计贡献率达到84.191%。根据主成分分析结果，计算18个新疆野苹果无性系的综合得分(表5)，其中M12得分最高，为0.975；M16得分最低，为-0.865。

18个新疆野苹果无性系基本特性描述见表6。

表6 18个新疆野苹果无性系基本特性

由表6可知，M4树形优美，生长旺盛，是观枝、观叶的优良品种，是园林绿化中不可多得的树种；M11、M12果实品质较好，是优良的观果品种。

3 讨论与结论

18个新疆野苹果无性系10个形态指标变异系数的变化范围为2.19%～15.91%，南北冠幅的变异系数最大(15.91%)；18个新疆野苹果无性系10个生理指标变异系数的变化范围为2.04%～13.58%，叶绿素b的变异系数最大(13.58%)。18个新疆野苹果无性系各性状指标变异幅度较大，说明新疆野苹果遗传多样性较为广泛，选择育种潜力较大。

树高、地径、冠幅能够直观地反映出树木的生长势，是筛选优良品种的重要形态指标。叶绿素类、类胡萝卜素类、类黄酮类和甜菜碱色素是存在于植物叶片中的主要色素，它们都属于植物体内的次生代谢产物，正是这些色素的相互作用才使植物的各个器官(叶片、花、果实等)具有了一定的色彩[30]。叶绿素是植物体内与光合作用最为密切的一种色素，对植物的生长发育起着至关重要的作用，同时也是优良种质资源评价的重要指标[31-32]。可溶性糖和可溶性蛋白是植物体内重要的渗透调节物质，与植物的生长发育及抗逆性密切相关。因此，经常把这2个指标作为筛选优良种质资源的重要指标[33-34]。

本研究显示，各无性系叶绿素总量与树高、地径之间的相关系数分别为0.872、0.841，呈现极显著的正相关关系，说明叶绿素总量的高低直接决定着新疆野苹果生长的快慢，该研究结果与赵洪兵等在小麦叶绿素与农艺性状以及光合特性的研究结果一致[35]；与张杰等对蒙古栎叶绿素含量与其树高、地径相关性的研究结果一致[36]；也与孙小霞等在火炬松生理生化指标与生长性状的相关性研究结果一致[37]。其主要原因是叶绿素的含量直接影响着植物的光和作用，从而间接地对植物的生长发育造成影响。

本研究中，花青素的含量与叶片色度参数a*值呈现极显著正相关关系，相关系数为0.820，这与李单等对李属植物的研究结果一致，说明叶片色度参数a*值与叶片中花青素含量密切相关[30]。

基于10个形态指标和10个生理指标进行聚类分析，18个新疆野苹果无性系被分为5类，充分说明了新疆野苹果的遗传资源较为丰富。

无性系M12树体高大，生长势旺盛，得分最高；无性系M16树体矮小，生长势较弱，得分最低。