孙月欣，刘凯,，冯启科，李林晴,，王红霞

(1 河北农业大学 园艺学院，河北 保定 071001; 2 河北农业大学山区研究所，河北省山区农业工程技术研究中心，国家北方山区农业工程技术研究中心，河北 保定 071001)

bHLH(basic/Helix-Loop-Helix，碱性-螺旋-环-螺)转录因子是仅次于 MYB 转录因子家族的第二大基因家族，通过使特定的氨基酸残基与靶基因相互作用，从而进一步调节相关基因的表达[1-2]。经大量研究发现，bHLH转录因子在调节类黄酮和花青素的生物合成以及种子种皮色素积累中发挥着重要作用[1-2]。

花青素在植物中分布广泛，是植物的主要水溶性色素之一，属类黄酮的1种，是花色苷水解而得到的有颜色的苷元，花青素由类黄酮途径的特定分支产生，在应对各种非生物胁迫方面，许多植物通过积累花青素来提高植株的抗寒能力[3-4]。研究表明，调控花青素合成途径的转录因子主要分属在3个基因家族中：MYB家族、bHLH家族和WD40家族[5]。由WD家族蛋白TTG1与bHLH转录因子、MYB转录因子结合形成1种三元复合物(简称MWB)，许多调控基因都是通过直接或间接参与构成MWB复合物的方式来调控花青素合成途径[6]。在拟南芥中，花青素合成途径主要依靠MYB、bHLH、WD40-repeat以及bZIP4种转录因子的调控，大部分物种的花青素都是由这4类转录因子复合而成的蛋白复合体直接调控激活的，也有少数花青素合成只需要单个调控因子就能激活[7-8]。而在拟南芥中，参与调控花青素合成的bHLH蛋白：TT8 (At bHLH042)、GL3 (At bHLH001)、EGL3(MYC-146/At bHLH002)和MYC1(At bHLH012)均聚集于bHLH家族第3亚组(Subgroup III)。TT8能够依赖于TTG1 (WD40蛋白)和TT2(R2R3-MYB蛋白)来调节DFR和BAN的表达[9-10]。而在“红阳”猕猴桃果肉花青素形成过程中的调控作用研究中发现，AdGL3基因的表达水平与猕猴桃花青素的净积累过程基本一致，即在净积累过程中表达水平比较高，而净积累停止后，该基因的表达水平也相应降低[11]。由此可知，GL3基因在花青素的形成过程中起着重要作用。

核桃(JuglansregiaL.)，又名胡桃，是胡桃科，核桃属的落叶乔木植物，在我国有悠久的栽培历史，与扁桃、腰果、榛子并称为“世界四大坚果”，核桃素有“木本油料之王”的称号，是我国主要的经济林树种之一[12-13]。核桃是喜温树种，但是非生物胁迫特别是晚霜与倒春寒使核桃造成大面积减产[14-16]。目前为止，关于核桃在分子水平改善核桃耐低温胁迫还鲜有报道。本研究采用生物信息学技术对JrGL3结构和转录表达进行分析，为研究JrGL3基因调控核桃中类黄酮和花青素途径响应低温胁迫奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料是种植于河北农业大学标本园的“辽宁8号”(耐低温)和“清香”(不耐低温)核桃(JuglansregiaL.)盆栽[17]。试验材料分为正常组(冷处理0 h)和0.5 ℃(冷处理48 h)。低温处理48 h后采集每株第1片复叶上左数第2片单叶送至北京诺禾致源科技股份有限公司用于RNA-Seq测序，3次重复。不同组织(根、4月26日幼茎、4月26日幼叶、雄花、雌花、7月15日成熟叶)均采自河北农业大学标本园“清香”核桃，采集后液氮速冻，送至北京诺禾致源科技股份有限公司用于RNA-Seq测序，3次重复。

1.2 核桃JrGL3蛋白生物信息学分析

本试验中所用到的CDS序列与DNA序列均由NCBI提供下载。

分别利用 ORF finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)工具和 DNAMAN 寻找最长的开放阅读框和得到氨基酸序列；分别利用在线分析工具ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)、TMPred (https://embnet.vitalit.ch/software/TMPRED_form.html)、PSIPRED V4.0 (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)、SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/interactive)、SignalP 3.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)、TMHMM Serverv.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、NetPhos 3.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)和 MEME (http://memesuite.org/tools/meme)分析理化性质、跨膜结构、二级结构、三级结构、信号肽、磷酸化位点和聚类分析。分别利用 Plant-mPLoc、Plant CARE 和 DNAMAN 多序列比对工具分析亚细胞定位、启动子和多序列比对等参考肖化兴的方法[18]。利用 MEGA5.0软件构建系统进化树(Neighbor-joining, bootstrap 值设为 1 000)。用于系统进化分析的拟南芥蛋白序列来自TAIR 数据库。

1.3 表达分析

对“辽宁8号”(耐低温)和“清香”(不耐低温)的叶片进行0 ℃低温胁迫处理，并设置对照，48 h后进行RNA-Seq分析GL3基因转录表达量。针对“清香”不同组织进行RNA-Seq转录表达分析。

2 结果与分析

2.1 核桃JrGL3 cDNA 的基因信息分析

核桃JrGL3的序列搜索下载于NCBI已公布核桃蛋白序列，其基本信息，见表1。

表1 核桃JrGL3基本信息

由表1可知，JrGL3(GeneID：108979206)基因长4 982 bp，编码637 aa，有12个外显子，11个内含子，最大开放阅读框1 914 bp。

通过DNAMAN进行拼接组装，得到JrGL3cDNA基因克隆序列(图1)，结果显示JrGL3cDNA全长为4 982 bp，其1-637为该基因的编码区，开放阅读框的长度为1 914 bp，共编码637个氨基酸。

注: *是终止密码子。

2.2 核桃JrGL3基因编码氨基酸的理化性质、保守结构域及结构分析

利用ExPasy对基因的等电点(pI)、蛋白大小(kD)等蛋白理化性质进行预测，见表2。

表2 核桃JrGL3蛋白质理化性质

由表2可知，JrGL3分子量为71.15 kD，理论等电点为5.23，分子式为C3111H4968N862O984S30，原子总数为9 955，不稳定系数为58.43，表明其为不稳定蛋白，脂肪族氨基酸指数为87.21，平均总亲水性为-0.365，属于亲水性蛋白。预测其包含 20 种氨基酸，丝氨酸(Ser)含量最高，色氨酸(Trp)含量最少。

利用PSIPRED V4.0、SWISS-MODEL对核桃JrGL3结构和保守结构域的分析，见图2。

由图2可知，保守结构域分析(图2-a)发现其存在bHLH-SF超级家族的功能域，根据 NCBI 所带的注释信息可知该家族包括来自拟南芥的几个bHLH转录因子，如TT8、EGL1和GL3。JrGL3，也被称为AtbHLH1或AtMYC6。JrGL3蛋白的二级结构(图2-b)分析显示存在许多螺旋、β-折叠、延伸链和卷曲结构。分析JrGL3蛋白的三级结构(图2-c)，结果显示存在螺旋、折叠等结构。

注：(a)是JrGL3保守结构域预测；(b)是JrGL3二级结构预测；(c)是JrGL3三级结构预测。

2.3 核桃JrGL3磷酸化位点和跨膜结构分析预测

利用TMHMM Serverv.2.0、NetPhos 3.1对核桃JrGL3磷酸化位点和跨膜结构进行分析预测，见图3。

图3 JrGL3蛋白的磷酸化位点(a)和跨膜结构预测(b)

由图3可知，JrGL3磷酸化位点分析结果显示其氨基酸序列有可能发生磷酸化的氨基酸位点共有62个，酪氨酸磷酸位点5个，苏氨酸磷酸化位点15个，丝氨酸磷酸化位点42个(图3-a)，推测其主要是通过丝氨酸磷酸化调控相关功能。采用 TMHMM Serverv.2.0 进行分析预测，结果显示JrGL3不存在跨膜蛋白结构(图3-b)。

2.4 核桃JrGL3蛋白的信号肽、亚细胞定位、启动子分析和蛋白互作预测

利用SignalP 3.0 Server在线工具对JrGL3蛋白的信号肽进行分析，发现其不存在信号肽，预测其定位于细胞核中，说明JrGL3蛋白在核桃细胞的细胞核上表达。采用Plant CARE在线网址分析JrGL3基因的启动子区的顺式作用元件(图4)，发现存在光响应元件ACE、厌氧诱导调节元件ARE、启动子和增强子元件CAAT-Box、光响应调节元件G-Box和G-Box、低温响应元件LTR、赤霉素反应性元件TATC-Box。以拟南芥蛋白为参考，核桃GL3蛋白与拟南芥GL3蛋白为高度同源蛋白，在互作蛋白中，部分参与花青素的合成途径[8-11]，例如MYB75产生花青素色素1的转录激活剂，当与BHLH12 / MYC1、EGL3或GL3结合时，促进苯丙素衍生物如花色苷和原花青素的合成，见图5。

注: 方框里包括顺式作用元件的序列及名称。

图5 拟南芥JrGL3蛋白互作预测

2.5 JrGL3的同源性比对及进化分析

利用 DNAMAN 对JrGL3及与其同源性较高的序列进行多序列比对，结果显示，核桃 GL3 蛋白有bHLH-SF 功能域，植物bHLH结构域都具有一个在5、9和13位氨基酸残基分别是 H-E-R 的特征(图6)。

将JrGL3序列提交到 NCBI 蛋白质数据库中进行比对，JrGL3与核桃(Juglansregia， XP01880 5371)、欧洲栓皮栎(Quercussuber，XP023923836)、梅(Prunusmume，XP008238828)、桃树(Prunuspersica，XP020420271)、欧李(Prunusavium，XP02 1820872)、可可豆(Theobromacacao，XP0070402 49)、海棠(Malusdomestica，XP008392582)、枣(Ziziphusjujuba，XP015871249)、阿月浑子(Pistaciavera，XP031278483)、荔枝(Litchichinensis，APP94124)、月季(Rosachinensis，XP024174273)、 橡胶树(Heveabrasiliensis，XP021668375)、苹果(Malusdomestica，XP028960493)、葡萄(Vitisvinifera，XP002270239)、欧洲大叶杨(Populustrichocarpa，XP024445100)、番木瓜(Caricapapaya，XP021905999)、大麻(Cannabissativa，XP03050 1846)、榴莲(Duriozibethinus，XP022732906)、胡杨(Populuseuphratica，XP011029287)、蓖麻(Ricinuscommunis，XP015571770)、树棉(Gossypiumarboreum，NP001316962)、陆地棉(Gossypiumhirsutum，XP016724946)、雷蒙德棉(Gossypiumraimondii，XP012476149)、金杜鹃(Rhodamniaargentea，XP030551648)、茶(Camelliasinensis，XP028080 219)等25种植物进行同源性分析(图7-a)，结果表明，JrGL3与阿月浑子(Pistaciavera，XP0312784 83)和欧洲栓皮栎(Quercussuber，XP023923836)的亲缘关系最近，与梅(Prunusmume，XP008238828)和橡胶树(Heveabrasiliensis，XP021668375)等作物的亲缘关系最远。采用 MEME 分析核桃JrGL3和与其亲缘性较高的bHLH蛋白序列(图7-b)，预测了10个motif且标注了其在相应序列的位置，然而，橡胶树(Heveabrasiliensis，XP021668375)、葡萄(Vitisvinifera，XP002270239)、欧洲大叶杨(Populustrichocarpa，XP024445100)、胡杨(Populuseuphratica，XP011029287)、茶(Camelliasinensis，XP028080219)预测到9个motif。

注：方框记星号氨基酸是HER基序。

注:(a)核桃JrGL3氨基酸序列与其他物种氨基酸序列的同源树;(b)JrGL3与其他植物bHLH蛋白序列 MEME 聚类分析。

2.6 JrGL3在核桃不同品种和组织中的表达规律分析

利用核桃转录组中的数据分析核桃JrGL3基因在“辽宁8号”(耐低温)和“清香”(不耐低温)品种低温胁迫48 h后的表达规律，见图8。由图8可知，JrGL3在“辽宁8号”叶片呈现显著上升，比对照上升2.7倍；JrGL3在“清香”叶片呈现显著上升，比对照上升2.1倍。由此表明JrGL3基因在不同品种中均有表达，而在“清香”中表达量较高。

图8 JrGL3基因在不同品种中的表达分析

低温胁迫“清香”(不耐低温)48 h后，不同组织中JrGL3基因的表达分析，见图9。由图9可知，在“清香”品种不同组织转录组分析，JrGL3基因在“清香”雌花、根、成熟叶、幼茎、幼叶、雄花、芽中均有表达，其中JrGL3在雌花中表达量最高，而在雄花与老叶中表达量较低，说明JrGL3基因在不同组织中的表达量存在一定差异，但无组织特异性。

注：QXCH是清香雌花；QXG是清香根；QXLY是清香成熟叶；QXNJ是清香幼茎；QXNY是清香幼叶；QXXH是清香雄花；QXY是清香芽。

3 讨论与结论

bHLH(basic/Helix-Loop-Helix)转录因子是真核生物界中普遍存在的一类转录调节因子，是最大的转录因子家族之一[19]。拟南芥中有164个bHLH转录因子、水稻中有180个bHLH转录因子、枣树中有92个bHLH转录因子、烟草及白菜中分别有190个、230个bHLH转录因子，bHLH转录因子家族成员广泛参与调控植物的生长发育、植物代谢过程和抗逆过程[20-23]。杨娜等利用生物信息学对独行菜(Lepidiumapetalum) bHLH转录因子ICE1、bHLH27、bHLH7的结构及功能进行了分析预测，为进一步的bHLH转录因子在独行菜种子低温萌发过程中的研究奠定基础[24]。王艳敏克隆了小黑杨PsnICE1基因及其启动子序列并对其分析，为深入研究小黑杨PsnICE1转录因子应答低温胁迫调控的分子机理提供了理论依据[25]。本研究采用生物信息学技术对基因进行组装拼接，并对其进化关系进行分析预测，JrGL3含有bHLH结构域，属于定位于细胞核、无信号肽、无跨膜结构的稳定亲水的bHLH家族蛋白；同源进化分析表明，核桃与阿月浑子和欧洲栓皮栎聚为一个分支，阿月浑子进化距离较小，而与梅和橡胶树分支较多，进化距离较大，所以JrGL3与阿月浑子(Pistaciavera，XP0312 78483)和欧洲栓皮栎(Quercussuber，XP02392383 6)的蛋白亲缘关系较近，与梅(Prunusmume，XP00 8238828)和橡胶树(Heveabrasiliensis，XP021668 375)等植物的蛋白亲缘关系较远。通过JrGL3与其他植物bHLH蛋白序列多重对比，结果表明每个植物都含有其保守结构域，说明JrGL3蛋白保守。

JrGL3启动子区域存在多种顺式作用元件，如参与赤霉素等激素响应的顺式作用元件TATC-Box等；参与光、低温等非生物胁迫响应的ACE、G-Box和G-Box、LTR等；此外JrGL3的启动子区域存在一定数量的与厌氧响应相关的顺式作用元件ARE等。以上结果表明JrGL3可能是一个具有多种环境响应能力的转录因子。花青素合成中的GL3蛋白有典型的HLH结构域，其主要通过促进蛋白质相互结合形成的同型二聚体或异型二聚体复合体来调控植物相关功能通路[22,26]。对GL3的结构域功能进行分析，发现包含bHLH区域在内的GL3，其C端主要与bHLH之间形成二聚体有关，由此来介导GL3的花色苷代谢的转录调控和表皮毛发生调控。在拟南芥中，由 AtGLl、AtGL3和 AtTTG1形成MBW复合物通过正向调控激活AtGL2基因的表达，进而促进表皮毛的发生，而GL3与拟南芥内源的AtGL3竞争结合AtGL1，破坏了内源AtGL1-AtGL3-AtTTG1复合物对AtGL2的调控，进而抑制了表皮毛的发生，促进了花色苷的合成[27]。TOE1/TOE2与GIS/GIS2/ZFP8蛋白互作，作用于GL3上游，调控拟南芥表皮毛的发育[28]。茄子TTG1(WD40转录因子)与GL3和TT8(bHLH转录因子)相互作用，参与调控茄子花青素的合成[26]。杨树MYB6与GL3和TTG1相互作用形成MBW(MYB-bHLH-WD40)复合体来正调控单宁和花青素的合成[29]。在拟南芥中，R2R3 MYB转录因子GLABRA1(GL1)、bHLH转录因子GLABRA3/ENHANCER OF GLABRA3(GL3/EGL3)和WDR蛋白TRANSPARENTTESTAGLABRA1(TTG1)构成MBW转录激活复合体，激活GLABROUS2(GL2)的表达，进而诱导了表皮毛的发生[30]。本研究克隆得到的JrGL3基因具有与其他物种中调控花青素的bHLH类基因GL3相似的结构，结合蛋白互作预测推测是参与核桃中花青素合成的重要转录调控因子之一。

通过低温胁迫“辽宁8号”和“清香”核桃叶片48 h后转录组表达分析，JrGL3基因均呈现显著上升趋势。在“清香”不同组织转录组分析中表明，JrGL3基因在“清香”雌花、根、成熟叶、幼茎、幼叶、雄花、芽中均有表达，推测JrGL3在核桃响应低温胁迫方面具有显著影响，并且推测其可能参与核桃花青素合成过程响应低温胁迫。其中JrGL3在雌花中表达量最高，而在雄花与成熟叶中表达量较低，说明JrGL3基因在不同组织中的表达量存在一定差异，但无组织特异性，可能与其在不同部位的功能有密切的关系。JrGL3在拟南芥中的研究比较深入，已证明其功能与花青素形成相关，而对JrGL3基因调控核桃中类黄酮和花青素途径响应低温胁迫作用机制有待进一步研究。