石 林，逄铭源，陈丽倩，姜厚森，郭 佳，孙建民

（潍坊市人民医院，山东潍坊 261000）

踝关节骨性关节炎（ankle osteoarthritis,AOA）随着我国老龄化的加剧，患病率出现越来越高的趋势，成为最常见的关节炎[1，2]，最重要的特征性改变是关节软骨损伤[3，4]。然而当下对踝关节骨性关节炎的治疗只能缓解患者的疼痛及改善关节的功能，不能逆转关节的损伤或抑制其发展，最终手术干预不可避免。有研究表明，关节软骨损伤与转化生长因子 β1（TGF-β1）影响软骨代谢的机制有关。它具有双向性和多样性，在免疫、炎症等疾病中有重要作用[5，6]。作者对临床诊断为踝关节骨性关节炎的患者中进行软骨和血清中TGF-β1的测定，并与正常人对照，探讨TGF-β1的临床意义。

1 临床资料

1.1 一般资料

AOA组：为2017年07月—2020年06月在本院因AOA行关节镜手术或踝关节融合患者，术前临床与影像检查，以及术中所见确认为AOA。其中，男14例，女13例；年龄69～43岁，平均（50.30±7.12）岁，病程3个月～21年，平均（10.30±3.20）年。临床表现为关节疼痛、肿胀，受累关节局部可有压痛，有的被动运动时关节疼痛，过度活动后关节肿胀明显，疼痛加重。X线片显示关节间隙不匹配，软骨下骨质出现囊性变，关节边缘有骨赘形成，有部分患者距骨关节面萎陷、变形和关节出现半脱位等。

正常对照组：为同期因治疗其他疾病入院住院患者27例，病史、临床表现和影像检查踝关节均正常。其中，男10例，女17例；年龄75～32岁，平均（47.00±4.30）岁。此外，正常软骨组织标本3份，取自外伤或者截肢手术未累及踝关节的软骨组织。

本研究所有取标本的患者在术前谈话时向患者讲明，取得患者及家属的同意，签订知情同意书后采集，研究方案获得潍坊市人民医院伦理委员批准。

1.2 检测方法

血清TGF-β1检测：所有受试者空腹6～12 h后抽血1～2 ml，离心后取上层即为血清。所取标本放置在-20℃冰箱内保存待测。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法测定血清中TGF-β1，试剂盒为杭州华安科技生物有限公司产品。仪器是国产自动酶标仪和自动洗板机。按试剂说明书标准流程进行样品检测。

骨软骨组织观察与免疫组织化学染色：观察距骨关节面大体形态，取距骨骨软骨组织采用超敏SP免疫组织化学方法观察TGF-β1分布。使用罗氏自动免疫组化机，TGF-β1免疫组织化学试剂盒为杭州华安科技生物有限公司产品。取材后10%甲醛固定12～24 h，然后脱钙、脱水、透明、浸泡、包埋。石蜡切片烘烤30 min后常规二甲苯脱蜡至水，再用蒸馏水清洗一次，缓冲液清洗1 min，在玻片组织上滴加Ⅰ抗，4℃孵育经过一夜。第2 d用缓冲液冲洗3次，每次1 min后滴加Ⅱ抗，保持37℃孵育1 h。配制新鲜显色液，冲洗玻片3次，每次3 min，经二氨基联苯胺法分别染色1、3 min后停止显色，在显微镜下观察免疫组化染色结果并拍照记录。

1.3 统计学方法

所有数据均以±s表示，两组间数据比较用两样本t检验，有关指标采用相关分析。

2 结 果

2.1 血清TGF-β1检测结果

ELISA法测定血清中TGF-β1结果，AOA组（1 994.70±188.49）pg/ml，对照组为（1623.22±127.99）pg/ml，两组间差异有统计学意义（P＜0.001）。AOA组血清中TGF-β1的含量明显高于对照组。

2.2 大体形态观察和软骨组织TGF-β1免疫组织化学染色

大体形态观察：AOA组软骨表面粗糙不平，色泽暗淡，部分软骨剥脱及软骨下骨裸露；正常软骨组软骨表面平整，色泽正常，无脱屑。

TGF-β1免疫组织化学染色AOA患者骨软骨标本中TGF-β1染色阳性，其中，15例染色较深，呈强阳性，其中软骨下骨中可见多核巨细胞，胞浆呈深蓝色（图1a）。相比之下，正常软骨着色较淡，软骨下骨也可见多核巨细胞，但体积小，着色浅（图1b）。

图1 TGF-β1免疫组织化学染色（×400） 1a:AOA组，软骨下骨可见较大多核巨细胞，胞浆着色较深 1b:正常组软骨下骨亦可见多核巨细胞，但体积较小，胞浆着色较浅

3 讨论

AOA是一种以关节软骨被损坏为特征的退行性病变，主要表现为踝关节关节软骨面变粗糙、脱屑、部分软骨剥脱，关节镜下反光度差，关节面不匹配，周围骨赘形成，关节间隙变窄等。踝关节骨性关节炎的病因有很多，主要是以下几类：过度活动、劳累致使关节软骨损伤；软骨细胞基质降解造成软骨自身修复的能力下降[1～3]。AOA是一种复杂的疾病，其发病机制包括生物力学和代谢因素，这些因素改变了关节软骨和软骨下骨的组织平衡。细胞/细胞外基质（ECM）相互作用在关节软骨的病理生理学中起着关键作用，这些相互作用由细胞表面的受体与细胞因子介导。在生理环境中，受体调节细胞和细胞外基质信号，维持软骨平衡。IL-1、TNF-α和其他细胞因子激活软骨基质的降解酶，主要是金属蛋白酶（MMPs），它们通过放大级联按顺序激活。而生长因子，如TGF-beta、IFG、BMP、NGF等，不仅参与组织损伤修复，也在OA发病中起着重要作用[7]。

在AOA发生过程中，TGF-β1作为一个具有重要调节意义的因子，通过TGF-β1及其细胞内信号通路系统将信号传递到细胞核内而起到多种生理调节作用，在维持关节软骨正常结构和关节修复中有重要的意义[5，6]。本研究发现 TGF-β1在 AOA 中高表达，无论血清中TGF-β1还是局部组织中TGF-β1均较正常对照增加，说明它的作用不仅仅是修复软骨和抑制炎症，可能有加速关节软骨的破坏作用。有很多学者的研究也印证了本研究，Scharstuhl等[8]在老年小鼠的膝关节内多次注入TGF-β1会使关节周围形成骨赘，说明老年小鼠TGF-β1含量的增多可能加速骨性关节炎的发生。有研究表明TGF-β1在骨性关节炎的早期阶段可以促进软骨细胞的合成，骨性关节炎的晚期抑制软骨细胞的合成[9，10]。

本研究显示AOA血清中TGF-β1的含量明显高于对照组，AOA软骨细胞中TGF-β1蛋白阳性细胞数明显高于正常软骨细胞。说明TGF-β1的表达与AOA患者的病情相关，也提示TGF-β1在AOA的后期主要是抑制软骨细胞增生，加速关节炎的发生。