王少雷 谭冬飞 张 霞 苏美丞 张清阳 贾 曼 陈 刚

（中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业农村部农产品质量安全重点实验室，北京100081）

乳和乳制品对人体营养至关重要，是氨基酸、蛋白质、脂肪、水溶性维生素、钙、必需脂肪酸和其他几种生物活性化合物的载体，在多种生物化学和生理功能中具有重要意义。牛奶肽组学是蛋白质组学的一个分支领域，主要研究存在于牛奶基质中的肽的组成、相互作用和性质。牛奶中的肽具有抗菌、抗氧化、抗高血压、免疫调节等活性的保健功能性食品的潜在成分[1]。牛奶中抗菌肽对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑制作用[2]，这类肽N末端常为亲水性氨基酸残基，如赖氨酸、精氨酸等；C末端含被酰胺化疏水残基如丙氨酸、甘氨酸等[3]。FARVIN等[4]发现抗氧化肽几乎都含有1个脯氨酸残基，部分为含有脯氨酸、组氨酸或酪氨酸，且N末端含有疏水氨基酸的肽段。LEE等[5]研究发现，大多数ACE抑制肽在C末端含有酪氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基酸残基和脯氨酸氨基酸残基，且亮氨酸对增加ACE抑制肽抗血压能力有显著加强作用。

牛奶中生物活性肽主要是通过耐热性蛋白酶从乳蛋白中释放出来。牛乳中的耐热蛋白酶来源于乳本身（即内源性蛋白酶）和牛乳污染微生物（外源性蛋白酶）[6]。内源性蛋白酶主要是纤溶酶，一般是由血液转运至乳腺并分泌进入乳中；外源性蛋白酶主要是嗜冷菌胞外蛋白酶，原料乳中的嗜冷菌大多数来自榨乳过程各环节造成的污染[7]。这些酶耐热性较强，即使是UHT乳中纤溶酶的活性尚存30%～40%，残留的酶活性将在产品货架期内缓慢作用于牛奶蛋白而导致产品出现黏度增加、蛋白凝结和乳清析出等质量问题[8]。本文对多肽组学技术研究手段以及其在乳品中的应用进行了综述，以期为乳品多肽组学的相关研究提供参考。

一、多肽组学技术

肽组学一词最早于2000年2月由SCHULZKNAPPE在美国生物分子资源设施协会年会（ABRF）“从单一到全球生物系统分析”上提出[9]。该方法已在神经内分泌研究、生物标志物或药物发现等领域取得成功。多肽组学是对生物样品中的肽进行全面定性和定量描述的技术，主要研究分子量为0.5～15 kDa的肽或小分子蛋白质，这正是传统蛋白质组学技术难以覆盖的区域[10]。

肽组学是蛋白质组学研究的新方向，许多蛋白质组学数据分析工具可以直接用于肽组学，因为后者在某种程度上是前者的一个子领域。但两者也有所区别，牛奶样品中多肽含量极低，而且容易被大量高丰度蛋白质掩盖其多肽组信息；很多小分子量蛋白质多肽和高丰度蛋白结合在一起，去除高丰度蛋白质的同时不可避免地会造成这些小分子蛋白质多肽的丢失，即导致多肽组信息的丢失。因此多肽组学研究也需要特定工具扩展、发明和验证程序的出现。多肽组学这一新概念旨在对小多肽进行全面的可视化和分析，从而涵盖蛋白质组学和代谢组学之间的质量范围[11]。

（一）肽的提取与分离生物基质通常含有脂类、盐、蛋白质和碳水化合物，这些物质会降低肽的电离效率，并可能导致液相色谱平台污染的问题。因此利用质谱技术从复杂的生物基质中鉴定和定量分子，通常需要对感兴趣的化合物进行选择性富集[12]。多肽提取方法具有高度多样性，并在一定程度上受到蛋白质组学方法的指导，且每种方法均具有自己独特的优势并且互为补充。

1.有机溶剂沉淀法。有机溶剂沉淀法是最简单的除去复杂样品中大分子蛋白质的方法。其原理是加入有机溶剂降低了溶液的介电常数，导致溶液中大分子量蛋白质之间疏水作用力下降、静电作用力增强，从而使其蛋白质发生聚集析出，而溶液中的多肽溶解在有机溶剂中达到分离目的[13]。经常使用的一种简单方法如通过加酸（如三氯乙酸）、使用不同的有机溶剂（如冷丙酮）或这些沉淀剂的组合以达到沉淀蛋白质的目的。刘媛等[14]通过单因素试验和正交试验优化硫酸铜、饱和食盐水、乙醇、乙酸铅、三氯乙酸沉淀牛乳中蛋白氮的最佳沉淀条件，结果表明，三氯乙酸为沉淀牛乳中蛋白质的最佳沉淀剂。马玉敏等[15]对比了不同种类和比例的有机溶剂提取乳制品中多肽，通过检测MALDI响应值高低和出峰范围，确定牛奶和乙腈比例为1∶3时提取效果最佳。DALABASMAZ等[16]采用5%醋酸调节牛奶pH值至4.6达到酪蛋白等电点的方式将其离心除去，收集上清液用于多肽检测。

样品采集后的另一个重要初步步骤是防止进一步的蛋白水解作用。蛋白酶活性可通过蛋白质变性、使用溶剂和三氯乙酸选择性沉淀、微波辐射或添加蛋白酶抑制剂来降低。选择不改变肽结构的抑制剂和使用不掩盖质谱中肽信号的浓度很重要[17～18]。该方法相对于其他方法具有快速、简单、成本低的优势。NEBBIA等[19]采用体外动态系统对生母乳、高温短时杀菌母乳和低温长时杀菌母乳样品添加兔胃提取物进行胃肠消化模拟，消化30、60和90 min后加入胃蛋白酶抑制剂A防止进一步消化。

2.超滤离心法。超滤技术是以膜表面的微孔结构为介质,以膜两侧的压力差为驱动力对样品进行选择性分离的膜分离技术[13]。根据实验需求选择特定分子截留量的超滤膜，样品经过超滤后只允许溶液中小于特定分子量的多肽通过，而大于特定分子量的蛋白质被截留在膜上方从而达到选择性分离。超滤技术在多肽组学样品前处理中得到了广泛应用，但该方法的最主要问题是超滤时上层浓缩后的大分子堵塞膜孔，出现差率速度降低或堵塞，而且其他低分子量污染物例如盐类也会同时被浓缩，不利于进一步分离和检测。因牛奶中主要蛋白质为酪蛋白、乳白蛋白和乳球蛋白，分子量较大，故采用超滤方法除去蛋白时最常用的是10 kD超滤膜。

3.固相萃取法。固相萃取（SPE）是用于分析前处理和纯化样品的一种常规方法。该方法通常用于脱盐和去除高含量蛋白质，作为液相色谱多级分离纯化和浓缩肽与蛋白质的替代方法。SPE可以根据聚合物吸附剂的色谱相互作用在样品中分离。较短的烃链（如反相C4和C8）通常用于蛋白质的分离。尽管较长的烃链（C18）是分离小分子和肽的首选[20]，但其主要缺点是在多肽组分被富集的同时，样品中高含量的蛋白质也会被富集出来，降低了多肽样品的富集效率和选择性。常用StageTip对牛奶中肽混合物进行脱盐和除去高丰度蛋白并浓缩，具有选择性地富集或预分馏。StageTip作为自制工具具有灵活和低价格的特性，与ZipTips（Millipore）商业产品对比，除了成本相对较低外，ZipTips还存在回收率低和洗脱量大等问题，故StageTip得以广泛应用[21]。

（二）肽分析牛乳中存在573种蛋白质[22]，其中大多数肽来源于αS1－酪蛋白、αS2－酪蛋白和β－酪蛋白。根据多肽的氨基酸数目，可将肽组学分为3组，即大肽（＞25个氨基酸）、中肽（7～25个氨基酸）和小肽（＜7个氨基酸）[23]，其中大多数生物活性肽属于小肽。由于缺乏短而独特的蛋白质序列，因此单靠数据库搜索无法提供有用的肽序列信息，这对基于质谱的肽组学分析提出了挑战。另外，当使用低碰撞能量时，串联质谱的质量差[24]，故采用更高的碰撞能量的飞行时间质谱（TOF）和轨道离子阱（orbitrap）提供更高质量的光谱和重现性[23，25]。

大多数肽组学研究是采用液相色谱－电喷雾串联质谱（LC－ESI－MS/MS）方法进行的。乳制品中生物活性肽属于低质量范围，MALDI的基质干扰影响很明显，这严重限制了MALDI－MS在肽组学研究中的应用。除液相色谱外，毛细管电泳（CE）也被广泛应用于多肽的分离。

（三）肽的定量在定性分析之后，量化是下一个重要分析步骤。定量分析样品间肽含量的微小差异是肽组学中最重要和最具挑战性的任务之一。标记（同位素和等压）和无标记定量均可用于肽组学。

1.无标记定量。无标记肽定量可以通过提取肽信号强度或光谱计数来进行。离子信号强度法使用提取的色谱面积来比较不同样品的肽丰度。光谱计数是指在数据依赖性采集实验中，选择1个肽进行碎片化和识别。尽管无标记定量通常被认为定量效果较差，但它不需要额外的样品制备，允许使用更小的样品量，并且所有分析平台都可实施。目前牛奶中肽谱鉴定大多采用无标记定量方法完成，通过选择内标肽对比色谱峰面积进行相对定量。DALABASMAZ等[26]将200μL酸化乳样品与50μL参考标准溶液（Biotin－XGXLDLRQGMFA－NH2）混合进行肽谱分析后，将参考肽m/z1558.8的强度设为100%，并与不同样品的肽强度比较。最后选择肽m/z1 589.9作为内源性内标物，在所有进一步的实验中将其强度设为100%，然后进行统计数据评估。

2.等压标记。等压标记允许在单个分析中复用多个样本，这提高了吞吐量，并且由于目标肽的共电离作用，使定量更加精确。主要的等压标记方法是iTRAQ[27]和TMT[28]，这些技术在蛋白质组学中得到广泛应用，但仅在少数肽组学研究中得到应用。

3.同位素标记。质谱定量通常是用同位素标记的样品进行的。同位素标记与等压标记相比，优点是不需要肽碎片来进行定量。由于自动化MS/MS的循环时间通常不允许样品中的所有肽碎片化，同位素标记至少在最初允许对更多肽进行定量。另一方面，随着同位素的使用，离子信号的数量增加，同位素标记光谱更加复杂[12]。

4.单反应和多反应监测。一旦肽序列被识别出来，MRM就可以根据肽离子分解过程中形成的特定产物的检测进行定量。MRM通常与三重四极杆仪器配合使用，广泛应用于蛋白质定量分析，具有高度的敏感性和特异性[12]。基于MRM的定量方法的一个主要缺点是，必须先对肽序列进行识别，才能确定要测量的目标。

（四）生物信息学生物信息学是任何组学质谱分析不可分割的一部分。多肽质谱生物信息学一般通过两方面进行，一是采用免费软件对多肽的单同位素质量计算、质谱/质谱碎片模式、理论同位素分布模式等进行分析；二是购买商业软件如Mascot、PEAKS Studio、ProteinPilot等，对所得到的质谱信息进行数据分析，例如De novo的肽序列测定和生物标记物发现，得出质谱对应的肽段序列。肽数据库是肽组学研究者最重要的工具，多肽组学常用数据库主要有以下几类[29]，蛋白质/肽序列数据库：RCSB Protein Data Bank，https://www.rcsb.org/；UniProtKB，https://www.uniprot.org/；NCBI Protein，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/；BIOPEP，http://www.uwm.edu.pl/biochemia/； PepBank，http://pepbank.mgh.harvard.edu/；BioPD，http://biopd.bjmu.edu.cn/；SwePep，http://www.swepep.org/；EROPMoscow，http://erop.inbi.ras.ru/；MilkAMP，http://milkampdb.org/；PeptideDB，http://www.peptides.be/。蛋白质水解酶数据库和理论消化平台：PeptideCutter， http://web.expasy.org/peptide_cutter/； Enzyme Predictor，http://bioware.ucd.ie/～enzpred/Enzpred.php。潜在生物活性预测：PeptideRanker，http://bioware.ucd.ie/～compass/biowareweb/；BIOPEP，http://www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/en/biopep；AntiBP2，http://www.imtech.res.in/raghava/antibp2/。

（五）肽组学深入分析牛奶肽组学的主要目的是寻找和表征生物活性肽，但也会涉及到蛋白质组学研究。首先需要确定生物活性肽源于的蛋白质，对乳制品进行分析以确定在特定加工/贮存条件下蛋白水解途径是肽组学研究的重要组成部分，它结合了肽组学和蛋白质组学分析技术[30]。其次，需要对牛奶蛋白质翻译后修饰进行表征，已确定对活性的影响。

二、多肽组学在牛奶上的应用

（一）基于肽谱鉴定不同温度处理的牛奶近年来，人们认为肽组分的组成可能是反映牛奶热处理的敏感和选择性标记。牛奶和奶制品的肽谱受加热过程的影响，不同的加热程序通过选择性热蛋白裂解和选择性灭活蛋白酶或蛋白酶抑制剂来改变肽谱[31～32]。此外，热处理导致美拉德反应，其产生的自由基可以选择性攻击蛋白质主链产生肽段[31]。HINDLE等[33]研究了牛乳经热处理后，溶于12%三氯乙酸（TCA）滤液中的肽和糖肽的释放情况，得出随着热处理温度的升高和热处理时间的延长，肽释放量增加。MORALES等[34]根据溶于12%三氯乙酸（TCA）滤液中的肽和糖肽的释放情况检测到两个肽，在加热过程中显示出时间依赖性的增加。随后，MELTRETTER等[35]将固定化金属亲和色谱（IMAC）与基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI－TOF－MS）结合分析对生乳天然肽部分进行了初步研究，发现5种肽受到加热时间和温度依赖性的高度影响。SASSI等[36]使用MALDITOF－MS肽分析和主成分分析结合方法筛选出28种肽区分生牛乳、巴氏杀菌奶、UHT和奶粉。BAUM等[37]直接应用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI－TOF－MS）或通过反相高效液相色谱（RP－HPLC）或OFFGEL分馏对乳肽进行预分馏，用于综合分析原料乳的肽谱鉴定出248种肽。EBNER等[31]结合使用C18－StageTip和MALDI－TOF－MS进行肽提取，对同一乳制品厂的高温短时（HTST）、延长货架期（ESL）和超高温（UHT）牛奶的肽指纹鉴定，确定了16个肽的相对数量随着热负荷的增加而变化，并通过对购买的HTST牛奶加热实验得出β－酪蛋白196－209的肽（m/z1460.9）可能是一个非常敏感的热影响肽标记物，被认为是商业牛奶样品中的候选标记物之一。DALABASMAZ等[26]在StageTip微萃取后通过MALDI－TOF－MS鉴定巴氏杀菌奶、ESL奶和UHT奶选择m/z为1701.0的焦谷氨酸－β酪蛋白194-209（pyroQ－βcasein194－209） 作为标志肽，通过UHPLC－ESI－MS/MS鉴定标记肽，用pyroQ－βcasein194－209可以将UHT牛奶与温和加热的牛奶区分开，准确度为100%。由于其高可靠性和灵敏度，该肽可用于常规分析以监测乳的热处理。DALABASMAZ等[16]通过MALDI－TOF－MS确定出7种标记肽的组合模型具有95%的准确度，以区分加热ESL乳、过滤ESL乳以及巴氏杀菌乳。

（二）基于肽谱鉴定牛奶贮藏时间MELTRETTER等[35]将IMAC与MALDI－TOF－MS结合分析，在4℃下对延长保质期牛奶（ESL）进行的贮存试验并未显示肽谱的任何变化，而在室温下贮存的UHT牛奶中，有一种肽（α－s1－酪蛋白的N－端）显著增加。EBNER等[31]结合使用StageTip和MALDI－TOF－MS对同一乳制品厂的不同贮藏时间的高温短时（HTST）和超高温（UHT）牛奶的肽指纹鉴定，筛选出5种肽可鉴定不同贮藏时间的巴氏杀菌奶和14种肽可鉴定不同贮藏时间的UHT奶。DALABASMAZ等[38]通过MALDI-TOF-MS的非靶向肽分析对9种不同的商用超高温样品进行分析，记录其保质期内和保质期结束时的肽分布，对这些肽的相对定量和测序表明，β－酪蛋白192－206（m/z1668.9）是区分过期超高温与常规超高温样品的最合适标记，准确率100%。此外，β－酪蛋白191－206（m/z1782.0）显示100%特异性，β－酪蛋白139－161（m/z2696.4）显示100%敏感性。因此，β－酪蛋白192－206单独或与β－酪蛋白191－206和β－酪蛋白139－161结合，提供了一种基于蛋白质水解机制监测UHT牛奶贮存的可靠标记物。

（三）基于肽谱鉴定牛乳腺炎患有乳腺炎的奶牛乳汁中纤溶酶、组织蛋白酶、弹性蛋白酶以及纤溶酶原激活剂会上调[39]。使用牛奶的多肽组学在临床和亚临床水平上检测乳腺炎，观察到健康牛奶中肽的总数是亚临床乳汁的1.5倍[40]。乳腺炎是一种乳腺炎症，是牛的一种常见疾病，导致产奶量低、质量差。MANSOR等[41]采用毛细管电泳和质谱技术，对临床乳腺炎奶牛和健康奶牛乳汁中的肽进行了研究，发现了154种可用作诊断性生物标志物的肽段；此外，还利用其中47个多肽来区分乳腺炎的病因是由金黄色链球菌还是大肠杆菌引起的。

（四）基于肽谱鉴定奶掺假在乳品领域，最常见的欺诈行为之一是将价值较高的奶（绵羊和山羊奶）与牛奶掺假。GUARINO等[42]基于液相色谱/电喷雾串联质谱（LC/ESI－MS/MS）分析奶酪中酪蛋白提取物的肽，建立了一种能够定量测定山羊和牛乳酪生产过程中添加绵羊奶的方法，该方法能够检测绵羊奶添加量为2%的奶酪。CALVANO等[43]基于直接基质辅助激光解吸/电离－飞行时间质谱分析，鉴定了7个主要的牛乳肽标记物和2个山羊乳的肽标记物，可以检测到牛奶和山羊奶最低掺假水平为5%。SASSI等[36]基于牛奶样品的肽组学和蛋白质组学分析，通过直接分析脱脂样品后，对鲜牛乳、水牛奶、绵羊奶和山羊奶的特异性肽和蛋白质标记物进行了鉴定。

三、展望

多肽组学技术是蛋白质组学研究的新方向，主要研究分子量为0.5～15 kDa的肽或小分子蛋白质，涵盖蛋白质组学和代谢组学之间的质量范围，是对乳品中的肽进行全面定性和定量描述，系统全面地研究乳品中多肽的组成、功能和变化。因牛奶样品中多肽含量极低，易被大量高丰度蛋白质掩盖其多肽组信息，且很多小分子量蛋白质多肽和高丰度蛋白结合在一起，导致传统的蛋白质组学前处理方法并不能完全适用。通过多肽组学研究可以帮助理解乳品中肽谱，寻找差异肽段研究其生物活性，从而为监测加工工艺、储藏时间、奶牛健康状况和掺假提供理论基础和技术支持。