李晓英，吴涛 ，陈曼丽，张翠召，宫蕊

1 河北省儿童医院成人内科，石家庄050031；2 河北省儿童医院泌尿外科；3 石家庄市第三医院老年病科；4 石家庄市第三医院检验科

骨关节炎（OA）是一种广泛流行的退行性关节疾病，其特征是软骨基质逐渐丧失，骨量减少，关节软骨破坏和骨赘形成［1］。OA 的发病机制仍不清楚，目前尚无预防和治疗OA 的有效方法［2］。环状RNA（circRNA）是一类呈环状结构的非编码RNA，富含与微小RNA（miRNAs）相结合的位点，在细胞中发挥分子海绵的作用，可解除miRNAs 对靶基因的抑制作用。先前研究显示，circRNA 在多种疾病中发挥重要的调控作用［3-5］。circRNA 在 OA 发生发展中的生物学作用及确切机制尚不明了，但目前已有研究证实差异表达的 circRNA 参与了 OA 的发病［6］。既往研究显示，circRNA 中的hsa_circ_0023404 可通过调控miR-136/TFCP2/YAP信号通路，在宫颈癌的发生过程中发挥致癌作用［7］。此外，circRNA 可通过调控多种信号通路参与疾病的发生和发展［8-9］。目前，关于 circRNA hsa_circ_0023404 对 OA 软骨细胞影响的研究较少，其调节机制也处于探索阶段。2019 年 2 月—2020 年 2 月，本研究观察了 hsa_circ_0023404 对OA 软骨细胞增殖和凋亡的影响，并探讨其机制是否与调控JAK/STAT 信号通路及炎症因子有关，为深入了解OA 的发病机制并寻找新的分子靶标用于临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 选取石家庄第三医院收治、拟行膝关节置换术的OA 患者10 例，均符合中华医学会骨科学分会OA 诊断标准，年龄50～75岁，排除全身免疫性疾病及结缔组织增生性疾病。患者手术中避开表面覆盖的纤维软骨，取中心部分的关节软骨，立即放入含抗生素的DMEM 培养液中。本研究经医院伦理委员会批准，患者及家属均签署知情同意书。

1.1.2 细胞 人正常软骨细胞购自美国ATCC 细胞库。

1.1.3 主要试剂 DMEM 培养基和胎牛血清均购自美国Gibco 公司，青—链霉素和胰蛋白酶均购自美国 Hyclone 公司，RIPA 蛋白裂解液和 BCA 蛋白定量测定试剂盒均购自美国Thermo 公司，ECL 化学发光检测试剂盒和SYBR Green PCR Master Mix 检测试剂盒购自日本TaKaRa 公司，CCK-8检测试剂盒购自日本同仁化学研究所，Lipofectamine 2000 转染试剂购自美国Invitrogen公司；hsa_circ_0023404 siRNA及对照siRNA 均购自上海吉玛制药技术有限公司；RNA 提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司，反转录试剂盒购自大连宝生物工程有限公司，AnnexinⅤ-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD 公司；白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素 8（IL-8）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA 检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，JAK-3、STAT-3一抗和二抗购自美国CST公司。

1.2 人OA 软骨细胞的分离和培养 参照文献［10］方法分离人OA 软骨细胞：将术中收集的软骨组织标本在超净工作台上切成约1 mm3的小块，PBS洗涤数次；加入胰蛋白酶，37 ℃条件下消化30 min；加入Ⅱ型胶原酶，37 ℃条件下消化16 h，每隔4 h 收集1 次细胞。采用200 目滤网过滤消化后的细胞，1 000 r/min 离心5 min，去上清，使用含10%胎牛血清的培养基洗涤细胞，将细胞以1×105/mL 接种到培养瓶中，5%CO2、饱和湿度、37 ℃恒温培养箱中进行培养。及时更换细胞培养液，待细胞生长密度达90%时，以胰酶消化细胞并进行传代培养，取第3代处于对数生长期的细胞进行后续实验。

1.3 细胞分组及转染处理 将人OA 软骨细胞以1×105/孔接种至 6 孔板，37 ℃培养箱中继续培养，待细胞汇合达60% 时，将细胞分为三组。siRNA 组、NC 组使用 Lipofectamine 2000 转染试剂分别转染hsa_circ_0023404 siRNA、对照siRNA，严格按照转染试剂盒使用说明书进行操作，Ctrl组未行转染。

1.4 细胞hsa_circ_0023404 表达检测 采用实时荧光定量PCR 法。①人OA 软骨细胞与正常软骨细胞：采用RNA 提取试剂盒提取总RNA，紫外分光光度计检测RNA 纯度合格后，使用反转录试剂盒将总RNA 反转录合成 cDNA，以 cDNA 为模板，使用SYBR Green PCR Master Mix 检测试剂盒进行PCR检测。采用2－ΔΔCt法计算细胞hsa_circ_0023404相对表达量，实验重复3次取平均值。②三组细胞：三组转染后48 h，参照上法检测细胞hsa_circ_0023404相对表达量。has_circ_0023404 上游引物5′-TTGTTACCTTCCGAGCCACC-3′，下 游 引 物 5′-TGCAAAGTCCCGTTCCAGAA-3′；内参 GAPDH 上游引物5′-GAGAAGTATGACAACAGCCTC-3′，下游引物5′-ATGGACTGTGGTCATGAGTC-3′。

1.5 细胞增殖能力观察 采用CCK-8法。将人OA软骨细胞以3×103/孔接种到96 孔板，参照1.3 进行分组处理，转染48 h后除去细胞上清液；向每孔细胞中添加10 mL CCK-8 检测试剂，置于37 ℃培养箱继续孵育2 h。使用酶标仪检测细胞在450 nm 波长处的光密度值（OD值），实验重复3次取平均值。

1.6 细胞凋亡能力观察 采用流式细胞术。取转染48 h 后的三组细胞，预冷PBS 洗涤，收集约1×105个细胞，加入结合缓冲液100 μL 悬浮细胞；再向细胞悬液中加入AnnexinⅤ-FITC 和PI 染液各5 μL，室温下避光反应15 min。上流式细胞仪检测细胞凋亡率，实验重复3次取平均值。

1.7 细胞上清液IL-6、IL-8 和TNF-α 水平检测 采用ELISA 法。将人OA 软骨细胞以1×104/孔接种到24孔板，参照1.3进行分组处理，转染48 h后收集细胞上清液。使用ELISA 检测试剂盒检测上清液IL-6、IL-8和TNF-α水平，实验重复3次取平均值。

1.8 细胞JAK-3、STAT-3 蛋白表达检测 采用Western blotting 法检测。取转染48 h 后的三组细胞，加入RIPA 蛋白裂解液提取总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度；取等量蛋白样品加入到上样孔，行SDSPAGE 电泳，待蛋白分离后电转至PVDF 膜上；将膜置于5%脱脂奶粉中封闭1 h，取出膜以TBST 洗膜3 次。加入 JAK-3、STAT-3 及 GAPDH 一抗（稀释比例均为 1∶500），4 ℃条件下孵育过夜，TBST 洗膜除去一抗；再加入二抗（稀释比例1∶3 000），室温孵育2 h，TBST 洗膜 3 次。采用 ECL 试剂盒进行显影，以GAPDH 为内参，计算目的蛋白相对表达量，实验重复3次取平均值。

1.9 统计学方法 采用SPSS21.0 统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人OA 软骨细胞与正常软骨细胞hsa_circ_0023404 表达比较 人OA 软骨细胞与正常软骨细胞hsa_circ_0023404 相对表达量分别为2.77 ±0.25、1.00 ± 0.10，二者比较P＜0.05。

2.2 三组细胞hsa_circ_0023404 表达比较 siRNA组、NC 组、Ctrl 组细胞 hsa_circ_0023404 相对表达量分别 为 0.17 ± 0.02、0.98 ± 0.09、1.00 ± 0.09，siRNA组明显低于NC组、Ctrl组（P均＜0.01）。

2.3 三组细胞增殖、凋亡能力比较 见表1、OSID码图1。

表1 三组细胞OD值及细胞凋亡率比较（）

表1 三组细胞OD值及细胞凋亡率比较（）

注：与Ctrl组及NC组比较，*P＜0.05。

组别siRNA组NC组Ctrl组细胞凋亡率（%）9.76±1.12*21.04±2.02 20.36±1.89 OD值0.45±0.04*0.35±0.03 0.36±0.03

2.4 三组细胞上清液 IL-6、IL-8 和 TNF-α 水平比较 见表2。

表2 三组细胞上清液IL-6、IL-8和TNF-α水平比较（pg/mL，）

表2 三组细胞上清液IL-6、IL-8和TNF-α水平比较（pg/mL，）

注：与Ctrl组及NC组比较，*P＜0.05。

组别siRNA组NC组Ctrl组TNF-α 10.16±1.04*20.88±2.01 21.03±1.92 IL-6 7.82±1.62*16.98±1.72 17.75±1.73 IL-8 13.06±1.35*26.11±2.71 25.29±2.49

2.5 三组细胞JAK-3、STAT-3 蛋白相对表达量比较 见表3、OSID码图2。

表3 三组细胞JAK-3、STAT-3蛋白相对表达量比较（）

表3 三组细胞JAK-3、STAT-3蛋白相对表达量比较（）

注：与Ctrl组及NC组比较，*P＜0.05。

组别siRNA组NC组Ctrl组STAT-3 0.30±0.03*0.59±0.06 0.58±0.06 JAK-3 0.22±0.02*0.45±0.04 0.46±0.04

3 讨论

circRNA 首先是在真核细胞中发现的，是一类新的非编码RNA，已逐渐成为非编码RNA相关研究领域的热点。随着高通量测序技术的快速发展，临床上逐渐发现circRNA 在生物体中的重要功能。越来越多的报道显示，circRNA 与肿瘤、心血管疾病、类风湿关节炎及阿尔茨海默病等多种疾病的发生密切相关，提示circRNA 可能作为疾病诊断的生物标志物或治疗靶点［11-13］。目前关于circRNA在OA发生发展中作用的相关研究较少，但已有研究证实circRNA 能够参与调节软骨细胞的细胞外基质降解、软骨细胞凋亡以及细胞炎症反应等。ZHOU 等［14］研究发现，circRNA Atp9b 作为竞争性内源RNA，通过靶向miR-138-5p 来调节软骨细胞的细胞外基质分解代谢和炎症反应，从而影响OA 进程。SHEN 等［15］研究指出，circRNA SERPINE2 过表达可通过miR-1271/ERG 途径，减轻人软骨细胞凋亡，促进细胞外基质合成代谢，为OA 治疗提供了潜在有效的靶点。LI 等［16］研究发现，环状 RNA hsa_circ_0045714 可以促进软骨细胞增殖，抑制软骨细胞凋亡。本研究结果显示，人OA 软骨细胞中hsa_circ_0023404 表达明显高于人正常软骨细胞，提示hsa_circ_0023404可能在OA的发生过程中发挥作用；而下调人OA软骨细胞hsa_circ_0023404 表达能够明显促进OA软骨细胞增殖，提示hsa_circ_0023404参与了OA的发生和进展。

JAK/STAT 信号通路参与机体生长、发育及疾病等过程，并且在细胞增殖、分化和凋亡等生物学行为中发挥重要作用［17-19］。研究显示，JAK/STAT 信号通路参与调控类风湿关节炎的发生发展，抑制JAK/STAT 信号通路激活能够明显减轻关节炎骨质的破坏［20-21］。JAK/STAT 信号通路不仅能够介导细胞增殖和凋亡，还能够影响相关炎症因子的分泌和释放，此外还可调控血管的生成［22］。研究显示，炎症因子IL-6、IL-8 和 TNF-α 水平升高与 OA 密切相关，并可能促进OA 发生及发展［23-24］。本研究结果显示，下调人OA 软骨细胞hsa_circ_0023404 表达能够明显减少JAK-3 和STAT-3 蛋白表达，同时细胞上清液IL-6、IL-8 和 TNF-α 水 平 也 明 显 降 低 ；表 明 抑 制hsa_circ_0023404 能够抑制JAK/STAT 信号通路激活并减少炎症因子IL-6、IL-8、TNF-α 分泌，但 JAK/STAT 信号通路与炎症因子之间是否存在调控关系仍需后续实验进一步验证。

综上所述，人OA 软骨细胞中hsa_circ_0023404表达异常升高，下调hsa_circ_0023404 表达可促进人OA 软骨细胞增殖、抑制细胞凋亡，其机制可能与抑制炎性因子分泌及JAK/STAT 信号通路有关。本实验初步探讨了hsa_circ_0023404 对OA 软骨细胞增殖和凋亡的影响及可能的机制，但是其具体的分子机制仍需后续实验进行验证，而hsa_circ_0023404对OA 软骨细胞其他生物学行为的影响及其相关作用机制也需深入探究。