别蓓蓓，白宏 ，方欢乐，吴梦迪

1 西安培华学院医学院药学系，西安710125；2 西安培华学院医学院基础医学系

肝细胞癌（HCC）作为原发性肝癌的主要类型，是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，恶性程度高，为全球第四大致死性肿瘤，对人类健康构成严重威胁［1］。尽管HCC治疗手段多样，包括手术治疗（肝切除、肝移植）、消融治疗（射频、微波）、放化疗、介入治疗、分子靶向治疗、免疫治疗等［2］；但由于HCC 发病机制复杂、早期病程隐匿、发病率高、预后差以及术后高复发与高转移等特点，特别是缺乏有效的早期诊断方法，导致患者病死率居高不下，迫切需要寻找可用于HCC 早期诊断、预后判断的生物标志物以及可应用于治疗的分子靶标。微小RNA（miRNAs）是一类长度为22～24个核苷酸的小分子非编码RNA，其可通过与靶基因的3′端非翻译区（3′-UTR）不完全互补或完全互补结合，进而抑制生物体内蛋白质翻译或者引起mRNA 降解，是转录后水平进行基因表达调控的重要分子之一［3］。大约50%的miRNAs在基因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点区，提示其在肿瘤的发生发展过程中具有重要作用。研究表明，miRNAs参与调控肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移等，其作为肿瘤生物标志物和治疗靶点具有巨大潜力［4-6］。近期研究发现了一条转录于人类5号染色体的miR-5003-3p，其在胃癌、乳腺癌组织中均异常高表达，可通过促进上皮—间质转化（EMT）参与肿瘤发生发展［7-8］。2021 年 3 月—6 月，本研究基于TCGA 数据库观察miR-5003-3p 在HCC 组织中的表达情况，并分析其与患者预后的关系，为miR-5003-3p应用于HCC的早期诊断及预后判断提供依据。

1 材料与方法

1.1 数据来源及处理 自TCGA 数据库（https：//portal. gdc. cancer. gov/）下载 375 例份 HCC 组织样本和50例份癌旁组织样本的miRNAseq 数据和患者临床资料、随访数据。汇总375例HCC患者的临床资料，其中男256例、女119例，年龄≤60岁178例、＞60岁196例；T分期：T1～T2期279例，T3～T4期93例；N分期：N0期256例，N1期4例；M分期：M0期271例，M1期4例；病理分期：Ⅰ～Ⅱ期261 例，Ⅲ～Ⅳ期90 例；肿瘤状态：荷瘤154 例，无瘤202 例；血清甲胎蛋白（AFP）水平：≤400 ng/mL 218例，＞400 ng/mL 65例；Child-Pugh分级：A级222例，B～C级22例；血管浸润：无208例，有112例；肝纤维化Ishak评分：0～2分106例，3～6分112例。miRNAseq数据通过edge R软件包进行过滤和标准化处理获得RPM（Reads per Million mapped reads）数据，经log2转换后用于后续分析。

1.2 HCC 组织中miR-5003-3p 表达分析 采用EdgeR软件包分别分析375例份HCC组织和50例份癌旁组织，以及49例HCC患者配对癌组织和癌旁组织中的miR-5003-3p表达情况。

1.3 miR-5003-3p 表达与HCC 患者临床参数的关系分析 375 例 HCC 患者按miR-5003-3p 表达中位数分为高表达组和低表达组，采用二分类单因素Logistics 回归模型分析 miR-5003-3p 表达与 HCC 患者临床参数（性别、年龄、T/N/M 分期、病理分期、肿瘤状态、血清AFP 水平、Child-Pugh 分级、血管浸润、肝纤维化Ishak评分）的相关性。

1.4 miR-5003-3p 对HCC 患者预后的预测价值分析 采用Kaplan-Meier 法比较高表达组和低表达组患者的10 年总生存期（OS）、疾病相关生存期（DSS）和无进展间隔期（PFI）。利用R 语言pROC 程序包绘制miR-5003-3p预测患者1、3、5年OS、DSS、PFI的受试者工作特征（ROC）曲线，通过曲线下面积（AUC）评价预测效能。

1.5 HCC 患者预后危险因素分析 运用COX 比例风险回归模型分析影响HCC 患者OS 的危险因素，其中单因素COX 回归分析结果P＜0.1 的临床指标进一步纳入多因素COX回归分析，总结影响HCC患者OS的独立危险因素。

1.6 统计学方法 采用SPSS20.0 统计软件。计量资料以表示，非配对组织表达差异分析采用Mann-WhitneyU检验，配对组织表达差异分析采用t检验；生存分析采用Log-Rank检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC 组织和癌旁组织中miR-5003-3p 表达比较 HCC 组织（375 例份）和癌旁组织（50 例份）中miR-5003-3p 相 对 表 达 量 分 别 为 0.432 ± 0.429、0.160±0.233，二者比较P＜0.01。配对的HCC组织和癌旁组织（各49例份）中miR-5003-3p相对表达量分别为0.547±0.491、0.163±0.233，二者比较P＜0.01。

2.2 miR-5003-3p 表达与HCC 患者临床参数的关系 根据miR-5003-3p 表达中位数将HCC 患者分为高表达组187例和低表达组187例。miR-5003-3p表达与T 分期（OR=1.955，P=0.006）、病理分期（OR=1.763，P=0.023）和肿瘤状态（OR=1.659，P=0.019）有显著相关性，而与年龄、性别、N 分期、M 分期、血清AFP、Child-Pugh 分级、血管浸润和肝纤维化Ishak 评分无显著相关性（P均＞0.05）。见表1。

表1 miR-5003-3p表达与HCC患者临床参数的关系

2.3 miR-5003-3p 表达对HCC 患者预后的预测价值 高表达组10 年OS、DSS、PFI均显著低于低表达组（P均＜0.01），见 OSID 码图 1。ROC 曲线结果显示，miR-5003-3p 预测 HCC 患者 1、3、5 年 OS 的 AUC分别为 0.655、0.627、0.586，预测 HCC 患者 1、3、5年 DSS 的 AUC 分别为 0.720、0.640、0.582，预测HCC 患者1、3、5 年PFI的AUC 分别为0.581、0.614、0.644，见OSID码图2。

2.4 影响HCC 患者OS 的危险因素分析结果 见表2、3。

表2 影响HCC患者OS的单因素COX回归分析结果

表3 影响HCC患者OS的多因素COX回归分析结果

3 讨论

越来越多的研究表明，miRNAs 在肿瘤组织中的表达失调参与了肿瘤的发生发展及耐药，已成为肿瘤生物标志物和治疗靶点研发的重要分子类型［9-10］。由于miRNAs 属于小分子核酸，可在各类体液中稳定存在，展现出了成为包括癌症在内的各类疾病非侵入性诊断生物标志物的巨大潜力，使得鉴定和开发可用于肿瘤诊断早期诊断、预后判断和疗效评估的新型miRNAs 分子标志物逐渐成为癌症研究领域内的热点［11-12］。最近研究发现，血清miR-193a-5p 可有效评估早期HCC 接受肝移植或肿瘤切除术患者的预后［13］；此外，血清miR-122对区分HCC患者与健康对照患者具有良好效果［14］。值得注意的是，近年来外泌体miRNAs作为生物标志物受到很大关注，由于被CCC膜结构包裹，miRNAs稳定性强，可显著提高检测灵敏度，非常适合用于肿瘤无创诊断。血浆外泌体miR-1307-5p 最近被证实在HCC 转移患者中高表达，且与肿瘤进展分期显著相关［15］。NAKANO 等［16］发现，血清外泌体 miR-92b 可作为潜在生物标志物用于肝移植后HCC复发的早期预测。

最近研究发现，位于人类5 号染色体的miR-5003-3p在多种肿瘤组织中异常高表达，且在肿瘤发生发展过程中发挥促癌作用。在乳腺癌中，miR-5003-3p 高表达可分别上调EMT 关键转录因子Snail和下调黏附分子E-cadhein，通过推进EMT 进程而促进肿瘤转移［7］。在胃癌中，miR-5003 高表达则可分别直接靶向抑制lncRNA RP11-789C1.1 和E-cadherin 表达，同样可通过影响EMT 进程而促进肿瘤的侵袭和转移［8］。目前对于miR-5003-3p 在HCC中的表达及其生物学作用则仍未见相关研究报道。本研究通过对TCGA 数据库中的HCC 样本miRNAs测序数据和临床信息数据进行生物信息学分析，发现miR-5003-3p 在配对和非配对HCC 组织中的表达水平均较正常组织显著上调，提示miR-5003-3p 具有作为HCC 诊断分子标志物的潜力。本研究结合TCGA 数据库HCC 患者的临床信息数据，进一步探讨了miR-5003-3p 表达水平与患者临床参数和预后的相关性；结果发现，miR-5003-3p 表达与患者T 分期、病理分期和肿瘤状态相关，高表达组10 年OS、DSS、PFI 均显著低于低表达组，且 miR-5003-3p 是影响HCC 患者OS 的独立危险因素，提示miR-5003-3p有望成为HCC预后判断的新型分子标志物。本研究ROC曲线结果显示，miR-5003-3p表达对于HCC患者的1、3、5年OS、DSS、PFI均具有良好的预测价值。

综上所述，HCC 组织中miR-5003-3p 表达升高，miR-5003-3p 异常高表达不仅与患者的T 分期、病理分期、肿瘤状态相关，还是影响HCC患者预后的独立危险因素，同时对患者预后具有良好的预测价值，有望成为HCC 诊断和预后判断的潜在生物标志物，为后续围绕miR-5003-3p 开展HCC 生物标志物的相关研究提供了依据。但本研究的miR-5003-3p 表达数据仅局限于HCC组织，后续可进一步对HCC患者血清/血浆游离或外泌体来源miR-5003-3p的表达及其临床相关性进行深入研究。