赵程祥 陈苏蒙 张宏达 贾 曼 孙永跃 陈 刚

(1.天津理工大学化学化工学院，天津300384；2.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业农村部农产品质量安全重点实验室，北京100081)

核磁共振（Nuclear magnetic resonance，简称NMR）技术是基于原子核磁特性的一种波谱技术，也是用于解释小分子和大分子结构的著名分析技术。具有化学位移和耦合常数的1H NMR谱图可以给出分子内和分子间共振的定量关系信息，因此NMR技术被作为鉴定有机化合物结构和研究化学动力学的先进仪器分析方法得到应用。NMR技术于20世纪中期由荷兰物理学家GOVETER最先发现，后由美国物理学家BLOCH和PURELL加以完善，两人也因此成就获得1952年诺贝尔物理学奖。1987年，ERNST等[1]首次利用傅里叶变换核磁共振光谱，将NMR技术扩展到二维层次。

近年来，NMR技术在食品质量与安全方面被广泛应用，因其处理复杂代谢混合物的特殊能力，也成为了食品代谢组学研究领域的首选技术。NMR方法学可用于表征食品的质量和真实性，也可用于识别假冒产品[2]。NMR可以根据具体应用，采取有针对性的方法（可以是靶向分析，也可以是非靶向分析）来识别特定食品中的特定标识物或掺假[3]。在某些情况下，食品真实性或掺假的表征不能简单地局限于单个或几个标记化合物的鉴定，必须根据几种化合物的组合或食品的整个代谢物特征进行分析。在这种情况下，就可以使用NMR的非靶向分析方法，这种方法允许对复杂混合物的化学成分进行表征，同时提供关于广泛代谢物或一组选定代谢物的信息。随着研究的深入，利用NMR技术分析有关食品欺诈和食品特性的复杂问题的研究已显著增多[4]。

虽然其他技术如气相色谱质谱联用（GC－MS）、液相色谱质谱联用（LC－MS）越来越多地用于食品质量与安全方面的研究，但NMR技术具有许多独特的优势，特别是对样品结构性质无损伤性、易于量化、几乎不需要或不需要分离、允许识别新化合物并且不需要化学衍生等优势[5]。NMR技术特别适合用于GC－MS或LC－MS难以分析的化合物，如糖、胺和挥发性酮等化合物。NMR技术的一个关键缺点是灵敏度不高，检测下限为1～5 mg，并且需要相对较大的样本量（500μL）。然而，随着近期更高磁场磁体（900 MHz）、低温冷却探头（将信号增加3倍）和小体积微探针（60μL）的引入，一些灵敏度问题开始变得不那么令人担忧[6]。

随着技术的发展，二维核磁谱图 （1H－1H COSY NMR、1H－1H TOCSY NMR、1H－13C HMQC NMR、1H－13C HMBC NMR）也被广泛地应用于定量检测与分析当中，而且二维谱图相比一维谱图有着更高的检测限和精密度，可以用于食品中微量物质的定量检测。

一、 核磁共振的原理

原子核是带正电荷的自旋粒子，表现出磁偶极矩。在外部磁场的作用下， 具有磁性的原子核存在不同能级，当用特定频率的电磁波照射样品，且当外加射频场的频率与原子核自旋进动的频率相同（Larmor频率）时，射频场的能量才能被原子核有收效地吸收。因此，对于给定的原子核，在给定的外加磁场中，只能吸收特定频率射频场提供的能量。原子核吸收电磁能发生跃迁，产生共振吸收信号，所得到的吸收图谱为核磁共振谱[7]。NMR现象来源于原子核的自旋角动量在外加磁场作用下的进动，而自旋角动量的具体数值是由原子核的自旋量子数决定的[8]。目前，只有自旋量子数等于1/2的原子核才能够产生共振信号，可以产生信号的原子核有1H、11B、13C、17O、19F、31P和23Na等。

二、核磁共振波谱技术在食品质量与安全方面的应用研究

（一）核磁共振波谱技术在水果质量与安全方面的应用在检测水果代谢物方面，KIM等[9]利用1H NMR技术研究了黑树莓果实不同成熟阶段各种化合物（如氨基酸、有机酸、糖和酚类化合物）的相对水平，还比较了3种不同溶剂体系中指定化合物的总数和种类。结果表明，随着黑树莓果实的成熟，蔗糖和大多数氨基酸及有机酸减少，而果糖、葡萄糖和花青素的相对浓度增加。JOHN等[10]利用1H NMR技术与主成分分析方法检测了蔓越莓标准品和3种蔓越莓补充剂，得到的大多数产品的代谢特征有很大差异，主要的差异代谢物包括柠檬酸和蔓越莓皮成分熊果酸、齐墩果酸和金丝桃苷。FRANCINI等[11]通过1H NMR技术对干苹果和新鲜苹果的多酚含量进行了研究，研究中将定量NMR光谱与主成分分析相结合，并量化了几种多酚（如儿茶素、表儿茶素和绿原酸），这些多酚对于确定不同品种的苹果的营养价值有着重要意义。VLASIOS等[12]开发了一种允许在一次运行中检测甜樱桃果实初级和次级代谢物的1H NMR方法，在研究中发现糖和有机酸的诊断峰位于脂肪族区域，酚类化合物位于芳香族区域，花青素位于8.2×10－6～8.6×10－6。这种方法为甜樱桃果实代谢物变化的定量和定性表征提供了统一的工具，可以进一步利用它来监测其他肉质水果代谢物随时间的变化。

NMR技术也可以用于水果成分与真实性的研究。DELPINO－RIUS等[13]利用1H NMR技术结合主要代谢物和酚类化合物的数据，来区分加工和未加工的桃泥、单独和混合的桃泥，也可用于区分梨汁的品种。ÇIÇEK等[14]使用二维定量NMR来选择性地确定罗汉果中11－α－羟基罗汉果苷的含量，从而预测罗汉果的甜味程度。将同核（COSY）和异核（HSQC）方法进行比较，发现两种技术都适用于罗汉果提取物的质量控制，二维定量NMR在准确度、精密度和定量限方面具有优势。MARCHETTI等[15]选择苹果汁、橙汁、菠萝汁和石榴汁为研究对象建立实验计划，根据中心复合设计（CCD）以不同比例混合研究对象，使用抑制水信号的核Overhauser增强光谱（NOESY）实验与偏最小二乘（PLS）回归分析相结合的方式进行分析，研究结果证明了1H NMR光谱数据结合多变量分析来开发和优化检测果汁掺假校准模型的可行性和优势。

在水果产地溯源方面，MARUENDA等[16]对来自秘鲁安第斯山脉8个不同地区的紫苏果通过NMR平台进行了代谢分析，明确鉴定出24种化合物，并对16种化合物进行量化。单向方差分析和事后图基（Tukey）检验表明，所有量化的代谢物在不同区域之间都存在显著变化，并通过偏最小二乘判别分析（PLS－DA）揭示了基于其代谢特征的区域之间的明显分离，突出了NMR在确定秘鲁紫苏果产区差异方面的区分能力。

（二）核磁共振波谱技术在蔬菜质量与安全方面的应用INGALLINA等[17]开发了一种NMR结合分光光度计的分析方法，将其用于分析芹菜提取物，并首次报道了芹菜提取物中存在某些酚，证实了低含量的生物胺和霉菌毒素与芹菜的质量和新鲜度有关。WANG等[18]利用1H NMR代谢组学的方法鉴定中国温县铁棍山药和其他山药之间的区分代谢物。代谢组学结果表明，中国温县铁棍山药的葡萄糖、果糖和蔗糖浓度较低，亮氨酸、苏氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、柠檬酸盐和胆碱浓度较高，可以根据葡萄糖和果糖的含量来验证中国温县铁棍山药的真实性。

在蔬菜产地溯源方面，KLARE等[19]利用非靶向1H NMR代谢组学成功区分了来自德国、波兰、荷兰、西班牙、希腊和秘鲁的237份白芦笋样品的地理来源。LEE等[20]使用1H NMR结合典型判别分析区分了韩国、中国和越南红辣椒粉的地理来源。研究表明，1H NMR光谱可以通过对与代谢物相关的信号进行适当的规范判别分析来区分红辣椒粉的来源。LAU等[21]采用同样的方法研究来自澳大利亚等3个地理来源的芹菜提取物之间的差异，发现糖、氨基酸和有机酸对不同来源的区分有显著贡献，甘露醇被确定为重要的区分代谢物。

低场核磁也经常用于蔬菜方面的研究，BORBA等[22]使用时域核磁共振（TD－NMR）技术，根据番茄成熟阶段显示不同的衰减时间的特性，开发准确且无损的分类模型。结果表明，与计算方法相关的衰减可用于番茄加工业并对番茄样本进行分类，这些分类模型显示了TD－NMR技术在处理高通量筛选应用中的潜力。LV等[23]研究了低场核磁共振（LF－NMR）技术用于测量6种微波真空干燥的蔬菜的在线水分状况。结果表明，蘑菇、胡萝卜、马铃薯、荷花、毛豆和玉米的信号幅度和水分含量没有单一的经验模型拟合，然而，在不同的微波真空干燥阶段，信号幅度和水分含量之间存在显著的线性关系。

（三）核磁共振波谱技术在肉制品质量与安全方面的应用NMR技术在肉制品方面的研究主要应用于辐照时间、代谢物和肉制品品质检测。MARIA等[24]利用1H NMR技术对牛肉中的共轭亚油酸（CLA）进行检测，该方法定量准确，除了可应用于牛肉检测外，还可应用于其他食品。ZANARDI等[25]研究利用1H NMR技术鉴别辐照牛肉和非辐照牛肉，主要标记物为甘油、乳酸及酪胺等化合物。RAYNA等[26]用1H NMR技术研究了不同剂量的γ射线辐照对鸡肉脂肪酸组成的影响，结果显示，多不饱和脂肪酰基减少的趋势与γ射线照射后肉类脂肪氧化稳定性的降低有关，据此可以用来鉴别辐照鸡肉和非辐照鸡肉。

YUAN等[27]评估了不同的干燥老化方式对牛腰肉质量属性和代谢物谱的影响，经感官评价发现，干燥陈年的腰部牛肉具有更好的风味并整体更受欢迎（p<0.05），但在嫩度和多汁性方面没有差异，滴漏/蒸煮损失和颜色也没有差异。代谢物分析表明，干燥陈年牛肉中的7种代谢物比湿陈年牛肉更丰富，有助于增强干陈年牛肉的风味。GARCÍA等[28]通过1H NMR分析，对经电子束辐照处理的猪里脊肉样品的7种分泌物进行了辐照剂量和贮存时间实验，确定猪肉渗出物的主要成分为核苷（IMP）和糖（α－Glc、β－Glc和α－Man）。GRAHAM等[29]利用NMR技术检测牛肉中极性代谢物组成及其含量随储藏时间的变化，结果显示，随着储藏时间的增加，蛋白质水解程度也会加深，表现为氨基酸含量上升等，这种变化可以作为牛肉储存时间的鉴定标准。KIM等[30]利用2D－NMR检测4周内不同老化状态牛肉的特征代谢物，发现在牛肉老化与蛋白水解的过程中，主要影响物质为3－吲哚氧基硫酸盐和γ－氨基丁酸，此方法可用于鉴别牛肉老化的程度。FONTES等[31]使用1H NMR光谱分析了3种肉块（夹头肉、牛腰肉和里脊肉）的30个样品，以确定储存期和温度的影响。结果显示，代谢物信号包括乙酸盐、肌酐、肌肽、富马酸盐、乳酸盐、亮氨酸、蛋氨酸和缬氨酸；得分图结果表明，温度对降解程度有巨大影响，原因是温度影响微生物种群的生长。

台式核磁也用于肉制品的研究，如利用LFNMR来确定生物系统中总脂肪和水分的含量。用于测定碎肉中脂肪的NMR方法被证明是一种稳健的方法，不需要对实验数据进行复杂的后期处理[32]。JAKES等[33]基于对60 MHz1H NMR光谱获得的甘油三酯特征的比较来区分牛肉和马肉，结合主成分分析给出的一个二维 “真实”牛肉区域 （p＝0.001），可以与光谱进行进一步比较，结果证明，60 MHz1H NMR可以作为一种可行的高通量筛选生肉的方法。

（四）核磁共振波谱技术在乳制品质量与安全方面的应用由于NMR技术能提供化合物中所有的氢原子信息,近年来关于NMR技术在乳制品方面的研究也逐渐增多，特别是乳制品中脂肪酸的定量分析方面。例如，MARIA等[34]利用1H NMR对意大利不同农场生产的奶牛奶和水牛奶中脂质成分进行表征，得出奶牛奶中不饱和脂肪酸和胆固醇含量均高于水牛奶，而水牛奶中丁酸和饱和脂肪酸含量高于奶牛奶。TOCIU等[35]基于1H NMR方法检测长链饱和脂肪酸与短链脂肪酸的比例，并利用标准气相色谱－氢火焰离子化检测器方法证实核磁共振方法提供的结果的准确性，经证实，该方法可以快速确定乳制品中植物脂肪的可疑掺假。HU等[36]在没有对全脂牛奶中的各种有机化合物做任何预处理的情况下，通过1D1H NMR和2D1H－13C HSQC核磁共振谱同时定量三酰基甘油的丁酸、总单不饱和脂肪酸和总多不饱和脂肪酸，并且首次定量牛奶中N－乙酰氨基水合物和三甲胺。

在针对乳制品代谢物研究方面，YANG等[37]利用1H－NMR技术研究中国荷斯坦奶牛、泽西牛、牦牛、水牛、山羊、骆驼和马的乳汁代谢物，得到荷斯坦牛奶的特征标志物为胆碱和琥珀酸，可用特征标志物将荷斯坦牛奶与其他乳用动物的乳汁区分开来，有助于更好地区别荷斯坦奶牛和其他乳用动物在乳汁合成方面的差异，以鉴别不同乳用动物的乳汁代谢物和检测乳制品的掺假。CUI等[38]利用1H－NMR和2D－HMBC NMR技术检测超高温牛奶和复原牛奶，选择左旋肉碱、琥珀酸盐、醋酸盐3种化合物作为生物标志物来区分超高温牛奶和复原牛奶。SCHIEVAND等[39]利用1H－NMR结合2D1H－1H TOCSY和2D1H－13C HMQC NMR快速检测奶酪中的组胺以实现对奶酪质量安全的监测。SEGATO等[40]利用1H－NMR技术鉴别基于高山牧场的阿齐亚戈PDO奶酪，结果显示，胆碱、2，3－丁二醇、赖氨酸、酪氨酸和一些糖类化合物的信号被认为是其主要的水溶性代谢产物，有助于识别最短成熟期的干酪样品。

在乳制品掺假方面，POLIANA等[41]探讨了应用1H时域核磁共振（1H TD－NMR）作为评估牛奶质量的快速方法，将乳清、尿素、过氧化氢和合成奶以5%、15%、25%、35%和50%（v/v）的浓度添加到牛奶样品中，通过建立回归模型，得到牛奶样品中的掺假水平有很强的相关性，开发了SIMCA和kNN分类模型，以根据掺假水平对掺假牛奶样品和掺假牛奶样品中的对照品进行分类，使用两种模型获得的结果显示出相似且非常令人满意的可预测性，说明1H TD－NMR可用作检测和量化牛奶掺假。BERGANA等[42]开发出一种通过溶液状态1H NMR结合一致性指数分析对正宗和掺假脱脂奶粉（SMP） 进行分类的非靶向方法。对于含有富氮小分子（三聚氰胺和双氰胺）的样品，在最低浓度（0.005%～0.05%）（w/w）下检测到掺假；对于尿素及蔗糖和麦芽糖糊精，检测阈值较高（0.5%）（w/w））。研究结果表明，1H NMR结合一致性指数分析可以支持SMP认证和检测掺假。

（五）核磁共振波谱技术在油脂类质量与安全方面的应用GUILLÉN和URIARTE[43]利用1H NMR技术研究煎炸过程中随温度升高葵花籽油品质发生的变化，并在氧化过程中同时监测化合物的官能团，经研究发现，乙醛的含量随温度变化明显，一些有毒物质（过氧化物、过氧酰基的共轭二烯体系、醛类）也随煎炸温度的升高而产生，同时食用油氧化过程中会形成二环氧化物被首次得到证实。之后，GUILLÉN等[44]又利用1H NMR结合傅里叶变换红外（FTIR）光谱研究了鱼肝油的脂质组成，其中FTIR光谱提供了样品中多不饱和酰基的摩尔百分比，以及不饱和与饱和结构之间的比率信息，1H NMR提供了某些酰基及一些次要化合物（胆固醇）的比例或浓度信息，经研究得出，该方法方便、简单，可以检测出饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的含量。

在油脂掺假方面，YVONNE等[45]利用1H NMR技术检测摩洛哥坚果油中单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸的含量来鉴别掺假摩洛哥坚果油。SOPELANA等[46]利用1H NMR技术检测不同品种的人造黄油中的脂质组成，结果发现多不饱和脂肪酸含量为22%～50%，单不饱和脂肪酸含量为23%～50%，饱和脂肪酸含量为21%～55%，证明该技术可快速简便地分析人造黄油的脂类成分。SAFWAN[47]利用1H NMR光谱和主成分分析（PCA）方法对8个品牌的40个黄油样品和7个品牌的35个人造黄油样品进行了研究，成功地对黄油和人造黄油进行了评估。GUYADER等[48]通过在常规实验室中建立13C NMR检测序列，能够分析23种常见食用油的来源，以及区分黄油、人造黄油和动物脂肪。该研究体现了通过化学计量学工具13C NMR检测各种商品品质真实性的潜力，这种方法也可以作为验证油脂真实性和完整性的全球方法。

（六）核磁共振波谱技术在其他食品方面的应用GOUGEON等[49]利用定量1H NMR技术对葡萄酒进行地理、年份和品种评估。该研究证明了NMR技术在葡萄酒鉴定中的潜力，方法具有快速（包括样品制备、分析和数据处理约20 min）和低体积（0.5 mL）的优点。CARVALHO等[50]将近红外光谱（NIRS）和NMR的无损方法应用于根据缺陷对带壳的澳洲坚果仁进行分类。RICHARDSON等[51]将NMR光谱结合化学计量学的方法应用到新鲜椰子水的掺假问题研究中。CONSONNI等[52]将NMR技术用于区分有机咖啡和传统咖啡，之后又应用于区分意大利有机和传统蜂蜜的研究中[53]。我国HE等[54]通过1H NMR结合多元分析，成功建立判别模型以鉴别真假蜂蜜，准确率为97.6%。此外，该研究筛选出脯氨酸、木二糖、尿苷、β－葡萄糖、松三糖、松二糖、赖氨酸等8种成分作为鉴别真假蜂蜜的主要成分，这些成分有助于建立蜂蜜认证的快速筛选方法，进而进一步管控我国蜂蜜市场。

三、结论

综上所述，核磁共振波谱技术作为光谱分析方法中最重要的一种，在学术研究中取得了卓越的成就。这种技术利用化学位移的差异，以及信号强度与共振核数成正比的优势，可分别用于定性和定量分析。在过去，常规核磁共振波谱分析方法的发展受到仪器成本高、灵敏度差和定量重现性差等因素的限制，但随着NMR技术的完善和提高，核磁共振波谱技术成为了非常适合分析复杂混合物的方法。核磁共振波谱技术具有测试程序快速、易于执行、无损，通常不需要复杂的样品制备或使用复杂的试剂，无辐射、安全高效、穿透能力强等诸多优点，促使其在食品科学研究领域将会有更为广阔的应用前景。