刘子宁 魏 津 汤新明 梁 琳 崔尚金*

(1.中国农业科学院 北京畜牧兽医研究所，北京 100193；2.农业农村部兽用药物与诊断技术北京科学观测实验站，北京 100193；3.中国兽医药品监察所，北京 100081)

犬副流感病毒(Canine parainfluenza virus, CPIV)为副粘病毒科(Paramyxoviridae)，腮腺炎病毒属(Rubulavirus)病毒，属副流感病毒5型(Parainfluenza virus type 5,PIV5)。CPIV与其他病原混合感染引起犬传染性呼吸道病(Canine infectious respiratory disease,CIRD)，又称犬传染性气管支气管炎，常发生于饲养环境拥挤密集的犬舍，且易反复爆发，难以根除；常引起整窝幼犬的集体感染，俗称“犬窝咳”[1]。近年来我国犬窝咳发病率呈上升趋势，其中CPIV的血清抗体阳性率可达30%～70%[2-3]。目前国内尚无针对CIRD的疫苗上市，仅有部分弱毒联苗包含CPIV[4]，且国外研究指出现有的商业CIRD疫苗均不具备高效的免疫保护力[1]，这可能与CPIV入侵宿主的过程不易受特异性抗体的影响有关[5]，因此，阐明CPIV致病机理、研发安全高效的疫苗需求迫切。另一方面，CPIV作为CIRD最主要的一种病原之一，具有感染性强但致病力弱、安全性高、基因组稳定、激发免疫应答全面等优点，所以通过构建感染性克隆平台能够实现对CPIV基因组的改造，具有作为CIRD或其他犬类疫病疫苗载体的潜能。综上，获得CPIV的基因组序列是开展CPIV致病机制等基础研究和疫苗及疫苗载体研制等应用研究的关键环节。随着先进理论和技术在兽医学研究领域的应用，解析毒株的遗传背景和演化关系是借助分子生物学等技术研制安全高效疫苗的前提与基础。但是由于PIV5并非人畜共患病，国内外针对CIRD的研究多以其流行病学和临床特征为主，对其病原的分子生物学研究还较少，现阶段GenBank发布的CPIV全基因组数据较少，仅有9株，年代也较为久远，且其中仅有两株来源于中国，中国流行毒株的基因组数据信息还需不断完善。

本实验室前期对具有呼吸道症状的病犬肺脏组织进行多重PCR检测，从感染CPIV的肺脏组织中分离得到了一株CPIV，命名为CPIV-BJ01，但尚未对其进行全基因组测序。本研究旨在了解CPIV-BJ01的全基因组序列特征，以期进一步完善和丰富中国CPIV流行株的基因组信息，为后续CPIV的致病机制、诊断和疫苗的研究提供基础数据。该数据还可用于构建CPIV感染性克隆平台，为进一步探究CPIV-BJ01全基因组中的突变对该毒株致病力及免疫原性等的影响提供可靠的科学平台，从而为探索CPIV-BJ01作为疫苗载体的研制及犬传染性呼吸道病等犬病的防控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病毒株、细胞、菌株和试剂

犬副流感病毒CPIV-BJ01株由本实验室分离和保存[6]； Vero细胞由本实验室保存、传代；Trans T1感受态细胞、pEASY-Blunt载体，均购自北京全式金生物科技有限公司；PrimerStar Max Mix高保真酶购自TAKARA Bio INC；病毒总RNA提取试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司；cDNA一步式反转录试剂盒购自天根生化科技有限公司。

1.2 引物设计

采用分段扩增的策略对CPIV-BJ01的基因组进行扩增(图1)。依据GenBank中PIV5 1 168-1(登录号：KC237064.1)全基因组序列设计6对引物(表1)，对CPIV-BJ01进行分段RT-PCR扩增。

图1 CPIV-BJ01全长分段策略Fig.1 The strategy of complete genome segmentation of CPIV-BJ01

表1 CPIV-BJ01分段RT-PCR引物设计Table 1 Primer design of of CPIV-BJ01 segmented RT-PCR

1.3 CPIV-BJ01的传代培养

取细胞状态良好、刚铺满至单层的Vero细胞，加入200 μL CPIV-BJ01病毒液，37 ℃感作1 h，然后加入含2% FBS的DMEM培养液，置于5% CO2恒温(37 ℃)培养箱内培养。每12 h观察一次细胞病变情况，出现80%的细胞病变时收集病毒液，重复上述步骤，完成病毒的传代。

1.4 CPIV-BJ01全基因组扩增

取第四代病毒液提取RNA并反转录为cDNA。以cDNA为模板，对各片段(图1)进行梯度RT-PCR扩增，取小于引物Tm值5 ℃内数值作为退火温度梯度，确定最适反应条件。20 μL反应体系，PCR反应条件：95 ℃预变性3 min； 95 ℃变性30 s，低于Tm值1～2 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min 45 s(目的片段>3 kb)或1 min 30 s(目的片段<3 kb)，35个循环；72 ℃终延伸10 min。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。回收与预测大小一致的目的片段，连接至pEASY-Blunt载体，转化后，对阳性菌液进行测序。

1.5 全基因组序列分析

分段测序结果用DNAstar SeqMan软件进行拼接，拼接结果由MEGA7软件与GenBank发布的27株PIV5参考毒株(表2)进行核苷酸和氨基酸序列的相似性比对，绘制其全基因组系统进化树及F、HN和SH基因系统进化树。

2 结果与分析

2.1 CPIV-BJ01感染Vero细胞的细胞病变

Vero细胞接种200 μL 105.5TCID50/0.1 mL CPIV-BJ01病毒液48 h后开始出现细胞病变，至72 h 出现明显细胞病变，可观察到接毒Vero细胞发生脱落、变圆、堆聚和拉丝等(图2(a))。正常细胞在72 h内贴壁生长，形成致密单层，生长速度也较接毒细胞快(图2(b))。

2.2 分段获得CPIV-BJ01全基因组序列

以CPIV-BJ01 cDNA为模板，分别以6对引物进行PCR扩增。扩增所得目的条带分别为2 051、3 023、2 816、3 130、3 047 和2 576 bp(图3)，与预期条带大小一致。

2.3 CPIV-BJ01全基因组序列分析

2.3.1CPIV-BJ01全基因组序列拼接

CPIV-BJ01株全基因组分段测序正确的片段用SeqMan软件拼接。结果显示CPIV-BJ01基因组全长为15 246 bp，核苷酸数目为6的倍数，遵循“六碱基原则”，基因组序列包括3′-UTR、NP、V/P、M、F、SH、HN、L和5′-UTR，基因组结构及其编码蛋白序列符合预期的副流感病毒典型特征[7-8]。结果表明，成功获得了CPIV-BJ01的基因组序列，为后续遗传变异分析奠定了基础。

表2 27株PIV5参考毒株信息Table 2 Information of 27 PIV5 reference strains

图2 CPIV-BJ01对Vero细胞的细胞病变效应Fig.2 Cytopathic effect of CPIV-BJ01 on Vero cell

F1～F6：CPIV-BJ01全长基因组的1～6片段。F1-F6: 1-6 fragements of the complete genome of CPIV-BJ01.图3 CPIV-BJ01全基因组分段RT-PCR扩增Fig.3 Segmentation RT-PCR of complete genome of CPIV-BJ01

2.3.2CPIV-BJ01全基因组相似性分析

将CPIV-BJ01株全基因组序列与GenBank发布的27株PIV5参考毒株进行比对，其核苷酸相似性为96.8%～99.9%，氨基酸相似性为92.3%～99.8%，表明CPIV-BJ01全基因组与参考毒株具有同源性。其中与1 168-1(KC237064.1)相似性最高，核苷酸相似性为99.9%，氨基酸相似性为99.8%；与T434(MK423237.1)相似性最低，核苷酸相似性为96.8%，氨基酸相似性为92.3%。CPIV-BJ01与其他参考毒株均不一致的特有突变为5 265位核苷酸由G变为A，位于F基因内，对应氨基酸由A变为T；6 467位核苷酸由C变为A，为非编码区核苷酸；7 922位核苷酸由G或A变为C，位于HN基因内，对应氨基酸由A或S变为H；15 220位核苷酸由A或T变为C，位于5′UTR内。

2.3.3CPIV-BJ01全基因组系统进化树构建

绘制CPIV-BJ01株与27株PIV5参考毒株的系统进化树。结果显示，CPIV-BJ01与犬源PIV5 1 168-1 分支最接近，与猪源PIV5 SH/2015/1202(MK028670.1)、虎源Mammalian rubulavirus 5(KY685075.1)、小熊猫源PIV5 ZJQ-221(KX100034.1)、虎源PIV5 HMZ(MH370862.1)、穿山甲源PIV5 GD18(MG921602)、猪源PIV5 CAN(MH362816.1)位于同一分支内(图4)。

图4 CPIV-BJ01全长序列系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree of complete genome sequence of CPIV-BJ01

2.4 CPIV F基因及HN基因序列分析

2.4.1CPIVF基因及HN基因相似性分析

将CPIV-BJ01株与27株PIV5参考毒株的F和HN基因进行比对分析，发现其F和HN基因与参考毒株具有同源性。其中CPIV-BJ01与1 168-1F和HN基因相似性最高，核苷酸相似性分别为99.9%和99.8%，氨基酸相似性均为99.6%；与T434F基因核苷酸相似性最低，为96.0%；与XJ033HN基因核苷酸和氨基酸相似性最低，分别为97.0%和96.6%；与N163(MK423243.1)HN基因氨基酸相似性最低，为95.1%。绘制进化树结果表明，CPIV-BJ01F和HN基因同全基因组的进化关系保持一致，CPIV-BJ01均与1 168-1、SH/2015/1202、Mammalian rubulavirus 5、ZJQ-221、HMZ、GD18、CAN位于同一演化分支。

2.4.2F蛋白糖基化位点预测

通过与参考序列相似性比对结果得知，CPIV-BJ01F基因第736位核苷酸由G突变为A，为该毒株的特有突变，该位点氨基酸由A变为T。通过YinOYang 1.2 糖基化软件预测结果显示，该处突变引起CPIV-BJ01在245位氨基酸处比相似性最高的1 168-1毒株增加了一处O-糖基化位点，未增加N-糖基化位点(图5)。

2.5 CPIV SH基因序列分析

PIV5SH基因CDS区位于第6 303～6 437位碱基，27株参考毒株的全基因组序列比对发现仅19个毒株在该区域有ATG起始密码子，KUN-11、China/HB01/2019、Rigel、CC-14、PV-BC14、SER、CPI+、CPI-不具有SH基因。将CPIV-BJ01SH基因与19株参考毒株进行比对，发现CPIV-BJ01SH基因与全基因组系统进化树中位于同一演化分支的7个毒株的相似性均为100%，具有完全同源性；而与其他演化分支毒株的核苷酸相似性最高为97.0%，最低仅84.4%，氨基酸相似性最高为95.6%，最低仅31.8%，显著低于全基因组、HN和F基因的比对结果，证明CPIV-BJ01SH基因与这些参考毒株仅部分同源或无同源性。绘制进化树结果表明了CPIV-BJ01与1 168-1、SH/2015/1 202、Mammalian rubulavirus 5、ZJQ-221、HMZ、GD18、CAN遗传演化关系的密切性(图6)。

图5 CPIV-BJ01 F蛋白糖基化位点预测Fig.5 Glycosylation site prediction of CPIV-BJ01 F protein

图6 CPIV-BJ01 SH基因系统进化树Fig.6 Phylogenetic tree of SH genome sequence of CPIV-BJ01

3 讨 论

CIRD是一种由多种病原体相继或协同作用引起的高度接触性传染病，其致病病原除CPIV外，还包括犬腺病毒2型(CAV-2)、犬疱疹病毒1型(CHV-1)和支气管败血波氏杆菌(Bb)等多种病毒、细菌和支原体[9]。因此，CPIV在病原分离过程中需进行多重筛选。本研究选用去除支原体，经多重PCR检测仅含有CPIV的病毒液，通过RT-PCR获得全长基因组序列。该序列与GenBank发布的来自不同国家、不同分离时间和不同宿主来源的27个有代表性的PIV5毒株比对发现，CPIV-BJ01全基因组与2009年在韩国分离到的犬源PIV5 1 168-1[10]相似性高达99.9%，与2016年韩国分离到的猪源PIV5 T434相似性最低，为96.8%。与CPIV-BJ01在系统进化树中位于同一演化支、核苷酸相似性在99.7%以上的PIV5毒株来源于多个不同的宿主，该结果与PIV5宿主来源多样且基因组无宿主特异性[11-12]的报道一致，证明其具有开发作为通用疫苗载体的潜能。副黏病毒科病毒疫苗研究的主要关注点是包膜糖蛋白F、HN和SH[13]。CPIV-BJ01F基因和HN基因系统进化树分支与全基因组进化树保持一致，表明F和HN基因在病毒演化过程中具有区分进化分支的代表性。HN和F蛋白与CPIV进入宿主细胞复制、传播及其免疫原性密切相关，F-HN蛋白间可发生相互作用[14]，有报道称HN蛋白部分氨基酸残基的改变与病毒抵抗中和抗体的能力有关，同时也可改变F蛋白的活化程度从而对膜融合产生抑制作用[15]。序列比对发现CPIV-BJ01编码区的两处错义突变均位于F和HN基因内，其中F基因内氨基酸序列的改变使其增加了一处O-糖基化位点，为CPIV-BJ01所特有，糖基化修饰与蛋白质的结构和功能密切相关，但这些氨基酸改变对F蛋白的功能及F和HN蛋白相互作用的影响还有待进一步研究。F基因在其他副黏病毒科病毒中常可作为区分毒株间差异的标志[16]，也有PIV5F基因与其流行和进化密切相关的报道[17]，但CPIV-BJ01与参考毒株F基因的相似性较高，证明CPIV遗传进化相对保守[18-19]。

此外，本研究还针对PIV5的第三种包膜糖蛋白SH基因进行分析，该蛋白在某些PIV5中不存在[11,17]，CPIV-BJ01测序结果显示具有SH基因，且与位于同一演化分支的其他7个PIV5毒株相似性均为100%，与其他演化分支毒株的核苷酸及氨基酸序列都差异较大，显著低于其与全基因组和F、HN基因的相似性，氨基酸相似性最低可达31.8%。该结果证明SH基因可作为PIV5毒株间遗传演化差异的分子标记。值得注意的是，目前研究指出PIV5的SH基因具有抑制TNF-α分泌从而阻断其介导的细胞凋亡作用[20]，即拥有SH基因的毒株感染细胞通常不造成CPE，为病毒形成长程感染提供有利条件。但本研究发现CPIV-BJ01虽然具备SH基因但仍可诱导细胞凋亡，证明CPIV-BJ01SH基因编码的小疏水性蛋白无法完全行使其功能，敲除该基因CDS区直接替换为外源基因的可行性较高[21]，使CPIV-BJ01具有更大的作为疫苗载体的应用潜能。

随着我国养犬数量的逐年递增，诸如CIRD这样的尚无高效疫苗的犬类传染病逐渐进入人们的视线，开发基因工程犬类疫苗是当今研究的热点。CPIV是疫苗载体的可靠候选毒株，利用反向遗传操作平台可敲除或改造CPIV的毒力基因，将CIRD相关的其他病原抗原基因插入CPIV基因组，获得安全的重组病毒而研制的疫苗，有望安全高效的实现一针防多种病原。本研究通过CPIV-BJ01全基因组测序与遗传变异分析，明确CPIV-BJ01特有的核苷酸和氨基酸变化情况及糖基化修饰的改变，为CPIV-BJ01反向遗传操作平台的构建提供基础数据，为进一步探究CPIV-BJ01全基因组中的突变对该毒株致病力及免疫原性等的影响提供可靠的科学平台，从而为探索CPIV-BJ01作为疫苗载体的研制及犬传染性呼吸道病等犬病的防控奠定基础。