王秋珍 邓自腾 刘雪连 闫 雪 宋维平 韩德平 马云飞*

(1.中国农业大学 动物医学院，北京 100193；2.北京大北农科技集团股份有限公司 饲用微生物工程国家重点实验室，北京 100192)

鸡白痢是一种由沙门菌感染引发的危害较大的传染性疾病。沙门菌为革兰氏阴性菌，可感染多种动物，在感染过程中依靠其毒力岛和黏附素对肠上皮进行黏附和侵袭，进入肠道进一步造成全身性的感染[1]。通过在日粮中添加抗生素可防治鸡白痢，但随着饲料中抗生素的禁用，益生菌逐渐成为一种饲用抗生素替代品。益生菌是一种能保持宿主肠道健康的微生态制剂，可以通过其代谢作用调节肠道菌群，维持肠道菌群的稳态，提升优势菌群的比例，进而提高动物体的免疫力。干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)作为重要的益生菌，具有生长速度快、耐酸耐胆盐能力强、口服后能在消化道大量存活等特点。干酪乳杆菌不仅能通过TLR4信号通路调节肠道的免疫炎症和氧化应激，还对肠道内多种病原菌如空肠弯曲菌、肠炎沙门菌和肠出血性大肠杆菌等有较强的抗菌活性[2-3]。在日粮中添加干酪乳杆菌代田株可提高断奶仔猪的生长性能和抗氧化功能，具有替代抗生素的功效[4]。干酪乳杆菌合成的生物硒纳米颗粒通过Nrf 2介导的信号通路保护小鼠肠道屏障功能[5]。干酪乳杆菌通过抑制NF-κB的活化，降低IL-1β和TNF-αmRNA的表达，抑制小鼠肠炎的发展过程[6]。以上研究结果表明干酪乳杆菌能增强机体肠道免疫并抑制肠道炎症的发生发展过程。小肠不仅是雏鸡营养物质消化吸收的重要器官也是机体抵御外来病原入侵的重要防线。本实验室前期研究表明干酪乳杆菌能够保护腹泻型大鼠回肠和断奶仔猪十二指肠的健康[7-8]，但干酪乳杆菌对感染沙门菌雏鸡空肠炎症的作用机制仍不清楚。本研究以1日龄雏鸡作为研究对象，采用HE染色和ELISA法，检测正常和沙门菌攻毒后的雏鸡在饲喂干酪乳杆菌后的空肠组织形态学和炎性因子表达量的变化，分析干酪乳杆菌对沙门菌感染雏鸡空肠黏膜上皮的损伤的保护作用，从而为干酪乳杆菌替代抗生素作为新型饲料添加剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计及样品采集

本研究所用干酪乳杆菌(LactobacilluscaseiDBN023)和沙门菌(SalmonellapullorumCMCC-533)分别由大北农饲用微生物国家重点实验室和中国医学微生物菌种保藏中心提供，分别作为益生菌和致病菌模式菌株。试验动物为SPF白来航初生雏鸡(购自：北京梅里亚维通实验动物技术有限公司；实验鸡场：国家粮食局科学研究院实验基地)将450只1日龄SPF健康雏鸡随机分为6个处理组，每个处理组5个重复，每个重复15只鸡，分组处理如下：

表1 试验设计Table 1 Experimental designing

基础日粮中添加的干酪乳杆菌的剂量为108CFU/g，7日龄时灌服沙门菌液的浓度为109CFU/mL，剂量为1 mL。

在28日龄时，每组每个重复随机选取1只雏鸡，颈动脉放血致死，剖开腹腔，取两段空肠中段2 cm 肠段，用PBS冲洗以除去肠内容物。一段在4%多聚甲醛溶液中固定48 h，期间换一次固定液，用于苏木精和伊红(HE)染色；另一段放入装有RNA store(DP408，天根生化科技有限公司，中国)液体的小管里，置于-80 ℃冰箱保存，用于进一步分析细胞因子水平。

1.2 空肠黏膜结构观察

取出固定液中的肠道，采用HE染色法观察肠道黏膜结构的变化。将固定好的组织块进行常规脱水、透明、浸蜡和石蜡包埋，制备4 μm厚的连续切片，进行HE染色。石蜡切片依次浸入二甲苯、梯度酒精进行常规脱蜡至蒸馏水；苏木素染色15 min后蒸馏水漂洗；1%盐酸-酒精溶液分色后，用自来水蓝化15 min；梯度酒精逐级脱水；浸入1%伊红染色50 s；常规脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。Nikon Ni-U显微镜观察、拍照并记录。

1.3 空肠中炎性因子的测定

取出-80 ℃冰箱保存的空肠肠段，用全自动样品研磨仪将组织破碎，离心，取上清。按照说明书用ELISA试剂盒检测空肠中细胞因子的含量。试验中所用的ELISA试剂盒均购自于上海江莱生物科技有限公司，分别是鸡白细胞介素-17(IL-17)ELISA检测试剂盒(JL21621)、鸡γ干扰素(IFN-γ)ELISA试剂盒(JL16053)、鸡肿瘤坏死因子(TNF-α)ELISA试剂盒(JL21706)、鸡白细胞介素-10(IL-10)ELISA试剂盒(JL21618)。

1.4 数据统计分析

本试验取得的数据采用GraphPad PrismTM5 (GraphPad Software,Inc.California,USA) 软件进行One-Way ANOVA单因素方差分析，结果用平均值±标准误表示。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著，P>0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 干酪乳杆菌处理对肠道组织结构的影响

从组织学的角度观察沙门菌和干酪乳杆菌作用后对雏鸡空肠造成的影响，结果显示：正常对照组与干酪乳杆菌组可见肠绒毛上皮杯状细胞与柱状细胞排列整齐，肠绒毛完整(图1(a)和1(c))；沙门菌组可见肠绒毛上皮杯状细胞严重脱落，柱状细胞排列不整齐，肠绒毛不完整(图1(b))；预防组和预防治疗组与沙门菌组相比，可见肠绒毛上皮杯状细胞部分脱落，柱状细胞排列更加整齐，肠绒毛更完整(图1(b)，1(d)和1(f))。

(a) 正常对照组；(b) 沙门菌组；(c) 干酪乳杆菌组；(d) 预防组；(e) 治疗组；(f) 预防治疗组(a) Control group; (b) Salmonella group; (c) Lactobacillus casei group; (d) Prevention group; (e) Treatment group;(f) Prevention plus treatment group图1 不同处理组中雏鸡空肠黏膜的形态学结构Fig.1 Morphological structure of jejunum tunica mucosa in chicks of different treatment groups

2.2 干酪乳杆菌处理对肠道IL-17和IL-10表达量的变化

不同处理组IL-17的表达量分析结果如图2(a)，与正常对照组相比，沙门菌组和预防组IL-17的表达量显著升高。治疗组和预防治疗组与沙门菌组相比IL-17的表达量显著降低(P<0.05)。从图2(b)可以看出，在28日龄的雏鸡空肠中，各组与正常对照组相比IL-10的表达量均显著降低。干酪乳杆菌组、预防组、预防治疗组与沙门菌组相比，IL-10 的表达量显著升高(P<0.05)。

A 正常对照组；B 沙门菌组；C 干酪乳杆菌组；D 预防组；E 治疗组；F 预防治疗组；柱上不同字母表示组间差异显著(P<0.05)。下同。A Control group; B Salmonella group; C Lactobacillus casei group; D Prevention group; E Treatment group; F Prevention plus treatment group; Columns marked with no common letters are significantly different (P<0.05) within groups. The same below.图2 不同处理对雏鸡空肠IL-17(a)和IL-10(b)表达的影响Fig.2 Effects of different treatments on IL-17 (a) and IL-10 (b) expression in jejunum of chicks

2.3 干酪乳杆菌处理对肠道IFN-γ和TNF-α表达量的变化

从图3(a)可以看出，各组与正常对照组相比IFN-γ的表达量均升高，差异均显著。与沙门菌组相比，干酪乳杆菌组和预防治疗组IFN-γ的表达量显著降低(P<0.05)。不同处理组雏鸡空肠TNF-α的表达量分析结果如图3(b)，各组与正常对照组相比TNF-α的表达量均显著升高。与沙门菌组相比，干酪乳杆菌组、预防组、预防治疗组的TNF-α表达量显著降低(P<0.05)。

图3 不同处理对雏鸡空肠IFN-γ (a)和TNF-α (b)表达的影响Fig.3 Effects of different treatments on the expression of IFN- γ (a) and TNF-α (b) in jejunum of chicks

3 讨 论

3.1 干酪乳杆菌对肠道发育的影响

肠道屏障主要包含4个方面：肠道物理屏障、免疫屏障、化学屏障和微生物屏障。肠道物理屏障能够阻止肠道中的细菌、内毒素等有害物质进入血液，在维持肠道稳态中起重要作用[9]。空肠是雏鸡营养物质吸收消化的主要场所，对雏鸡的生长发育有着重要作用。空肠的消化吸收主要依赖于肠绒毛，肠绒毛越完整，肠道的消化吸收能力越强。干酪乳杆菌作为一种益生菌，具有良好的益生特性，如耐酸性、胆汁抗性、抑制病原菌定植等[10]。研究表明，采食双歧杆菌和乳杆菌等能够在肠道定居的益生菌有望增加肠道中有益细菌种群，抑制大肠杆菌、葡萄球菌等病原体[11]。在北京黑猪育肥阶段日粮中添加干酪乳杆菌能减少空肠中埃希氏菌属-志贺氏菌属的相对丰度，有利于提高猪的生长性能[12]。将干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌和双歧杆菌按比例混合后添加至肉鸡饮水中可以增强空肠中消化酶的活性，改善消化道结构[13]。本研究结果表明，沙门菌攻毒后的雏鸡肠黏膜结构损伤，肠绒毛上皮细胞严重脱落；使用干酪乳杆菌预防和预防治疗的雏鸡肠黏膜完整性增加，肠绒毛上皮细胞脱落减轻，提示干酪乳杆菌可以减轻沙门菌对雏鸡肠黏膜的破坏作用。本研究与前人研究结果一致，干酪乳杆菌能够改善肠道形态。可能是由于干酪乳杆菌发酵降低肠道pH，抑制有害微生物繁殖，改变肠道渗透压，刺激黏膜发育[14]。

3.2 干酪乳杆菌对肠道免疫的影响

肠道免疫屏障可保护肠道免受外来微生物的侵扰，维持肠道稳态。肠上皮淋巴细胞位于肠上皮细胞之间，可分泌促炎因子和抗炎因子，是肠道免疫屏障的重要组成部分。肠上皮淋巴细胞是由CD4+和CD8+构成的T细胞群。肠上皮淋巴细胞刺激肠角质细胞生长因子的产生，调节肠上皮细胞的产生和分化[15]。本研究发现，与对照组相比，干酪乳杆菌组和预防组的肠上皮淋巴细胞数量增加，表明干酪乳杆菌能够提高肠道免疫，维持肠道稳态。与沙门菌组相比，预防组的肠上皮淋巴细胞数量增加，表明干酪乳杆菌可减轻沙门菌感染造成的雏鸡肠道损伤。IL-17是Th17细胞分泌的，主要作用是参与炎症反应并对其做出调整，它通过使肠黏膜上皮细胞和成纤维细胞产生趋化因子来调节粒细胞生成和中性粒细胞向肠固有层募集[16]。IFN-γ是肠上皮细胞稳态的负性调节因子，IFN-γ处理肠间质干细胞后可引发肠间质干细胞凋亡[17]。TNF-α属于TNF类细胞因子，由激活的巨噬细胞、树突状细胞、上皮细胞产生，是炎性肠病发病机制中最重要的介质之一。有研究表明TNF-α能诱导炎性肠病炎症组织中上皮细胞的凋亡和屏障的破坏、潘氏细胞的坏死，以及巨噬细胞产生炎性细胞因子[18-19]。研究结果表明，与沙门菌组相比，干酪乳杆菌组、预防组和预防治疗组雏鸡空肠中的IL-17、IFN-γ和TNF-α的表达量均下降，说明干酪乳杆菌可以减轻沙门菌对雏鸡肠道造成的炎性作用。IL-10是一类抗炎性细胞因子，大部分由淋巴细胞分泌，发挥免疫抑制的能力，它对于具有产生分泌促炎症因子的作用多种细胞有明显抑止作用，减少TNF-α和IL-6等细胞因子生成，调节多种免疫相关细胞等的生成与分化，降低炎症发生的概率[20-21]。本研究结果表明，与沙门菌组相比，干酪乳杆菌预防治疗后IL-10的表达量显著增加，表明干酪乳杆菌可以通过增加抗炎因子 IL-10 的分泌来维持雏鸡肠道健康。

4 结 论

饲粮添加干酪乳杆菌可提高雏鸡空肠黏膜的完整性，调节炎性因子的表达，减轻肠道炎症损伤，从而改善肠黏膜的屏障功能。