赵 丽， 关继奎， 陈嘉峰

随着食入性酒精的大量摄入，酒精中毒(alcoholism)引发脑血管病变及脑组织损伤的病例在我国日渐增多。虽然目前国内外对酒精中毒导致脑血管病变的机制已经有了深入研究，但是对于脑血管及脑组织的超微结构的损伤报道尚少。本实验制备了大鼠酒精中毒的动物模型，并通过透射电子显微镜观察酒精中毒组大鼠与对照组大鼠脑血管及脑组织超微结构的改变，并对两者之间的联系进行讨论。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 实验动物 Wistar雄性大鼠38只，体重200～300 g，由长春高新医学动物实验研究中心提供。同一批大鼠随机分为酒精中毒组22只与对照组16只，每笼5～6只，分笼饲养，按昼夜时程在室温及稳定湿度条件下以平衡饲料喂养，自然饮水。

1.1.2 主要试剂 食用酒精；无水乙醇(上海建原化工有限公司)；甲醛(山西开原化工厂)；蒸馏水；生理盐水。

1.2 方法 酒精中毒大鼠动物模型制备：Wistar雄性大鼠正常喂养1 w后开始造模。酒精中毒组：每天每只大鼠按8 ml/kg以50%食用酒精分两次进行灌胃，其间间隔6 h，2 w后改为每天每只大鼠按10 ml/kg用50%食用酒精分两次进行灌胃，1 w后再改为每天每只大鼠 按12 ml/kg用50%食用酒精分两次进行灌胃，其间间隔均为6 h，共灌胃4 w。对照组：同时用等量生理盐水进行灌胃。两组大鼠均灌胃4 w后应用4 ℃预冷的4%多聚甲醛及2%戊二醛按照1∶1体积配制的固定液经升主动脉灌注固定后取出脑组织，切成1 mm3的组织块置于3%的戊二醛中固定，逐级酒精脱水，Epon812定向包埋，超薄切片为700A厚度，经柠檬酸铅及醋酸铀染色，切片通过透射电子显微镜观察脑部超微结构改变并探讨脑功能损失相关机制。

2 结 果

2.1 一般情况 实验组最终可用于实验的大鼠15只，灌胃4 w后存活12只，死亡率为20%。2 w后对照组大鼠能够适应灌胃操作，体重正常增长。实验组大鼠始终存在灌胃困难。并逐渐出现反应迟钝、毛发干枯、脱落、倦怠、进食量减少、营养不良、消瘦等情况。灌胃2 w后约1/4的大鼠出现神经系统损伤表现：偏侧肢体瘫痪及病变侧霍纳氏征。3 w后两组大鼠的体重(g)差异有统计学意义(P<0.05)，4 w后两组大鼠体重差异有显著统计学意义(P<0.05)(见表1)。

表1 两组大鼠存活及体重(g)比较

2.2 超微结构改变 对照组大鼠小脑毛细血管内皮细胞为单层扁平上皮细胞，细胞表面有微绒毛突起。细胞核内周边处为染色较深的异染色质，常染色质(chromatin)位于细胞核的中央部分，染色较浅，分布均匀。核仁(nucleolus)明显。细胞质内细胞器丰富(见图1)。造模组大鼠小脑毛细血管内皮细胞同样为单层扁平上皮细胞，但细胞形状不规则，细胞表面的微绒毛突起明显减少，常染色质分布不均匀，异染色质增多，并可见丘状突起。核仁不明显。细胞质(cytoplasm)内细胞器明显减少(见图2)。对照组大鼠小脑毛细血管内皮细胞的细胞核为椭圆形，核膜完整，异染色质染色较深，位于周边，常染色质染色较浅，分布均匀，位于中央。并可见多个核孔。核仁明显，形状规则(见图3)。造模组大鼠小脑毛细血管内皮细胞的细胞核形状不规则，核膜断裂，染色质分布不均匀，见不到核孔，核仁不明显，形状不规则(见图4)。对照组大鼠海马(hippocampus)内的髓鞘结构(brain myelination)为由多层质膜构成的板层样结构。其切面呈同心圆状(见图5)。造模组大鼠海马内可见轻度脱髓鞘改变，多层质膜构成的板层样髓鞘有轻度脱落及破坏(见图6)。对照组大鼠额叶内线粒体(mitochondrion)为扁椭圆形，由两层单位膜包围而成，由内膜折叠形成的嵴为弯曲的管状，嵴平行排列，数目较多，嵴的切面为小泡状或者短管状。嵴上附有核糖体(ribosome)(见图7)。造模组大鼠额叶内的线粒体明显肿胀，近似圆形，两层单位膜显示不清晰，嵴出现断裂，数目减少，排列不规则。嵴上附着的核糖体有脱落(见图8)。对照组大鼠额叶内可见大量的管状粗面内质网(rough surfaced endoplasmic reticulum，RER)，彼此紧密平行排列，管末端膨大成池。管膜外表面附有核糖体，核糖体为单个散在或者以多聚核糖体的形式存在(见图9)。造模组大鼠额叶内管状粗面内质网断裂，长度减短，彼此间隔增宽，数量明显减少，分布不规则，管膜外表面附有的核糖体脱失(见图10)。

图1 对照组大鼠小脑毛细血管内皮细胞表面有微绒毛突起。细胞核周边为异染色质，常染色质位于中央，分布均匀。核仁明显。细胞质内细胞器丰富(×12000)。图2 实验组大鼠小脑毛细血管内皮细胞形状不规则，细胞表面的微绒毛突起明显减少，常染色质分布不均匀，异染色质增多，可见丘状突起。核仁不明显。细胞质内细胞器明显减少(×12000)。图3 对照组大鼠小脑毛细血管内皮细胞的细胞核为椭圆形，核膜完整，并可见多个核孔。核仁明显，形状规则(×20000)。图4 实验组大鼠小脑毛细血管内皮细胞的细胞核形状不规则，核膜断裂，染色质分布不均匀，见不到核孔，核仁不明显，形状不规则(×20000)。图5 对照组大鼠海马内髓鞘为多层质膜构成的板层样结构。其切面呈同心圆状(×40000)

图6 实验组大鼠海马内可见轻度脱髓鞘改变，多层质膜构成的板层样髓鞘有轻度的脱落及破坏(×40000)。图7 对照组大鼠额叶内线粒体为扁椭圆形，由两层单位膜包围，内膜折叠形成嵴，平行排列，数目较多，嵴的切面为小泡状或者短管状。嵴上附有核糖体(×80000)。图8 实验组大鼠额叶内线粒体明显肿胀，近似圆形，两层单位膜显示不清晰，嵴断裂，数目减少，排列不规则。嵴上附着的核糖体有脱落(×80000)。图9 对照组大鼠额叶内可见大量管状粗面内质网，彼此紧密平行排列，管末端膨大成池。管膜外表面附有核糖体，核糖体为单个散在或者以多聚核糖体的形式存在(×50000)。图10 实验组大鼠额叶内管状粗面内质网断裂，长度减短，彼此间隔增宽，数量明显减少，分布不规则，管膜外表面附有的核糖体脱失(×50000)

3 讨 论

慢性酒精中毒可引起体内生物酶活性改变，导致基本新陈代谢异常，同时还引起大量细胞毒性反应[1]。研究表明酒精中毒会引起胚胎发育期的浦肯野细胞和其他神经细胞变性，引起神经轴索变性，从而导致神经细胞凋亡[2]。大脑海马体主要负责长、短时间记忆、存储转换和定向等功能，是帮助人类处理长期学习与记忆声光、味觉等事件的主要区域。从1950年起，科学家就已经注意到大脑海马区与记忆间的关系，海马体在大脑中帮助人体记忆分析，记忆筛选，是人体的记忆系统，发挥所谓的“叙述性记忆”功能。海马神经元的退变是导致学习记忆功能减退的直接原因[3]。我们在酒精中毒大鼠的海马区发现由多层质膜构成的板层样髓鞘破坏了应有的同心圆结构，出现轻度脱落及破坏，是造成早期大脑认知功能障碍的原因之一；Porter、Claude和Fullam等人于1945年发现，他们在观察培养的小鼠成纤维细胞时，发现细胞质内部具有网状结构，建议叫做内质网(endoplasmicreticulum，ER)。分为粗面内质网及光面内质网两类。细胞质中内质网的发达程度与其生命活动的旺盛程度呈正相关，凡蛋白质合成旺盛的细胞，粗面内质网会更发达。粗面内质网含量的高低也常反映肿瘤细胞的分化程度。在神经细胞中，粗面内质网与记忆有关。慢性酒精中毒可以使蛋白质转运过程中未折叠或错误折叠的蛋白质存留在内质网或细胞质中，从而使内质网分子伴侣基因表达激活，引发内质网应激反应(endoplasmic reticulum stress response,UPR)，从而损伤内质网功能[4]。UPR通过降低蛋白质合成在有限程度上减轻蛋白质折叠给内质网带来的负荷，但是该调解有限，蛋白质过度堆积和钙稳态进一步失衡将导致细胞无法修复，乃至凋亡[5]；粗面内质网表面附着核糖体。Palade[6]于1955年在哺乳类与禽类动物细胞中首次发现，他将这种新细胞器描述为密集的微粒或颗粒。核糖体是一种核糖核蛋白颗粒，主要由RNA(rRNA)和蛋白质构成，其唯一功能是按照mRNA的指令将氨基酸合成蛋白质多肽链。当细胞受损时，粗面内质网上的核糖体脱落于胞浆内，蛋白质合成下降或消失。损伤恢复后其蛋白质合成功能也随之恢复。本实验已经能够证实酒精中毒大鼠额叶内管状粗面内质网断裂，长度减短，彼此间隔增宽，数量明显减少，分布不规则，管膜外表面附有的核糖体脱失，导致相关记忆性蛋白质合成下降，也是造成认知障碍的机制之一。但酒精中毒导致认知障碍的产生部位及时间顺序、干预措施需要进一步探索；据Rizzuto等[7]研究，内质网与线粒体之间存在很密切的关联，二者通过膜交换钙离子、脂质、糖化蛋白等物质。内质网稳态破坏会导致Ca2+摄取和转运障碍从而影响线粒体功能[8,9]。慢性酒精中毒造成机体游离自由基产生增多损伤神经细胞功能，同时使线粒体中电子传递链活性抑制，使三磷酸腺苷(ATP)产生减少及细胞损伤[10]。

本实验已经明确观察到酒精中毒后大鼠大脑额叶皮质细胞线粒体明显肿胀，近似圆形，两层单位膜显示不清晰，嵴出现断裂，数目减少，排列不规则。嵴上附着的核糖体有脱落。此种改变可能与UPR及ATP减少有关；酒精中毒后小脑血管的改变是导致共济失调及运动障碍的基础。小脑血管单层扁平上皮细胞的损伤直接导致小脑血液供应障碍，我们认为是后续运动功能及共济调节障碍的病理基础之一。这种酒精中毒导致的小脑血管细胞超微结构的损伤是否能完全修复、是否存在修复的阈值，需要我们后续研究进一步探索。