张 瑜， 李 捷， 高 元， 上官稳

急性缺血性脑卒中是目前被全世界广泛关注的疾病之一，其中约29%～37%的脑梗死患者[1]，在发病后其神经功能缺损症状逐渐进展或呈阶梯式加重，临床上称作“进展性脑梗死(progressive cerebral infarction，PCI)”[2]。

目前导致脑梗死进展加重的具体病理机制尚未完全阐明，除兴奋性氨基酸的毒性作用、线粒体功能障碍、氧化应激、炎性损伤外[3,4]，国内外多项研究表明[5,10]，细胞自噬也参与了脑缺血损伤的发生、发展过程。本文通过对PCI患者早期外周血中自噬改变的探讨，旨在为PCI的治疗提供新的干预靶点。

1 资料和方法

1.1 研究对象 连续收集2018年10月-2020年10月在河南科技大学第二附属医院神经内科住院治疗的急性脑梗死患者123例，纳入标准：(1)首次发病且于24 h内入院，并符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2014》所制定的诊断标准[6]。排除标准：(1)入院后行静脉溶栓或桥接治疗；(2)合并急性心肌梗死、严重肝肾疾病、恶性肿瘤、血液系统及免疫系统疾病；(3)入院前4 w存在严重感染、骨折外伤、重大手术及服用免疫抑制剂。进展性脑梗死的诊断标准：发病48 h内神经功能缺损症状逐渐进展或呈阶梯式加重(NIHSS评分增加≥2分)[7]。符合进展性脑梗死诊断标准的纳入PCI组(n=32)；符合急性脑梗死纳入标准但不符合进展性脑梗死诊断的纳入NPCI组(n=91)。其中PCI组男18例，女14例，平均(66.43±13.73)岁；NPCI组男52例，女39例，平均(65.49±11.33)岁。选取的对照组(n=37)为本院体检中心同时间段内的健康体检者，其中男21例，女16例，平均(63.74±12.94)岁。3组在性别、年龄上差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究经医院伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂和仪器 人淋巴细胞分离液(天津灏洋生物公司)、TRIzol试剂(Invitrogen公司)、反转录试剂盒(艾德来)；2×SYBR®Green 预混液(中国 DF)、analytikjena-Qtower2.2 型荧光定量PCR 仪(德国)、SCILOGEX D3024R离心机(美国)、普通 PCR仪analytikjena-Easycycler(德国)，人Beclin1酶联免疫检测试剂盒、人LC3-Ⅱ酶联免疫检测试剂盒、人P62酶联免疫检测试剂盒均购自上海商红(SRB)生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基线资料 记录PCI组和NPCI组的一般临床资料，主要包括性别、年龄、高血压、糖尿病、高脂血症、冠心病、吸烟、饮酒等，并采用美国国立卫生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale,NIHSS)评估患者入院时的神经功能缺损程度，记为基线NIHSS评分。

1.3.2 样本收集与处理 用EDTA抗凝管和普通血清管分别抽取PCI组和NPCI组入组后次日清晨的空腹肘静脉外周血各8 ml左右，分别用于提取人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)及血清。同期健康对照组的血液样本于体检当日采集。(1)PBMC分离、RNA提取及cDNA合成：按差速密度梯度法分离PBMC后，应用TRIzol试剂按说明书提取总RNA。所提取RNA溶于DEPC处理的去离子水中，用紫外分光光度法检测RNA的浓度及纯度，按反转录试剂盒说明操作，反转录成cDNA。(2)血清提取：将外周血以3000 r/min，离心10 min，提取上层血清后分装到无菌冻存管中，于-80 ℃冰箱冻存待检。

1.3.3 实时荧光定量PCR检测PBMC的Beclin1、LC3Ⅱ、P62 mRNA水平 取上述反转录合成的cDNA进行PCR扩增，总反应体积为10 μl。扩增程序：95℃预变性3 min；(95 ℃反应10 s，60 ℃反应30 s，72 ℃反应20 s)×40个循环。以GAPDH为内参，各自噬因子及内参基因的引物序列如下：Beclin1 上游5’-GTCCAACAACAGCACCAT-3’，下游5’-ACGGTCCAGGATCTTGAA-3’；LC3Ⅱ 上游5’-ATGTCAACATGAGCGAGTT-3’，下游5’-GTTCACCAGCAGGAAGAA-3’；P62 上游5’-AGAGACAAAGCCAAGGAG-3’，下游5’-AAGAGCATAAGCCTCACAT-3’；GAPDH上游5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’，下游5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’。采用2-ΔΔCt法计算各目标基因mRNA的表达水平。每组设置3个复孔，实验均重复3次。

1.3.4 ELISA法检测Beclin1、LC3Ⅱ、P62蛋白水平 按照各试剂盒说明书操作。

2 结 果

2.1 PCI组与NPCI组一般临床资料比较 两组研究对象在年龄、性别、高血压、糖尿病、高脂血症、冠心病、吸烟、饮酒、基线NIHSS评分等危险因素方面比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)(见表1)。

表1 PCI组和NPCI组基线临床资料的比较

2.2 自噬相关基因相对表达量的比较 PCI组较NPCI组和对照组Beclin1和LC3Ⅱ mRNA的相对表达量增高、P62 mRNA的相对表达量降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)。NPCI组较对照组Beclin1和LC3Ⅱ mRNA的相对表达量增高(P<0.05)、P62 mRNA的相对表达量之间无差异(P>0.05)(见表2)。

表2 3组研究对象Beclin1、LC3Ⅱ 及P62 mRNA相对表达量的比较

2.3 自噬相关蛋白表达量的比较 PCI组较NPCI组和对照组Beclin1和LC3Ⅱ蛋白的表达量增高、P62蛋白的表达量降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)。NPCI组较对照组Beclin1和LC3Ⅱ蛋白的表达量增高(P<0.05)、P62蛋白的表达量之间差异无统计学意义(P>0.05)(见表3)。

表3 3组研究对象Beclin1、LC3Ⅱ 及P62蛋白表达量的比较

3 讨 论

近年来，大量的研究证明[8～10]自噬参与了脑缺血及缺血-再灌注损伤的病理过程，并且影响神经细胞的生存和死亡。PCI作为缺血性脑卒中的特殊类型，具有较高的致残率和死亡率，临床预后欠佳，但关于PCI患者外周血中自噬水平的改变目前鲜少见诸报道，故深入研究其自噬机制具有重要的理论价值和现实意义。

细胞自噬是一种细胞通过自噬溶酶体降解细胞内容物的过程，自噬信号通路涉及多种因子[11～13]，其中Beclin1是自噬的直接执行者，也是介导其他自噬蛋白定位于自噬小体的关键因子。LC3Ⅱ 反应了自噬的激活，LC3-I转化为LC3Ⅱ 的检测可作为自噬囊泡形成的证据。P62与LC3直接结合，并被自噬所降解。因此Beclin1、LC3Ⅱ、p62 参与了调控自噬体的形成、成熟和降解的过程，故三者的表达量能够反映细胞的自噬程度。

本实验通过qRT-PCR和ELISA的方法分别检测自噬因子的mRNA和蛋白表达量，证实健康人外周血中Beclin1、LC3Ⅱ、p62有一定程度表达，存在自噬活性。同时NPCI组较对照组beclin1、LC3Ⅱ mRNA和蛋白的表达量增高，说明脑组织发生急性缺血损伤后，自噬途径被激活。PCI组较NPCI组的自噬水平更高，表现为beclin1、LC3Ⅱ 的mRNA和蛋白的表达量均增加、P62 mRNA和蛋白的表达量均降低。综合以上结果说明，适度的自噬可帮助细胞恢复内环境的稳态，促进损伤神经细胞的修复，但过度自噬可能诱导细胞死亡并加重缺血性损伤[14]。自噬的过度激活可能是导致PCI患者早期神经功能恶化和临床症状加重的发病机制之一，与Jiang[15]等的观点一致。

目前自噬在脑缺血损伤中的作用仍存在争议。Shu、Zhang等[16～18]发现，在脑组织缺血损伤的过程中通过施加药物或者治疗抑制自噬水平后，可以减轻神经功能缺损症状。Hwang、Wu等[19,20]的研究则显示应用自噬激动剂雷帕霉素提高自噬水平可以减少细胞凋亡和坏死，从而改善预后。以上研究结果不同，可能与不同的动物或细胞模型、不同的缺血时间点、不同的给药方法或预处理时间等多种因素有关。

综上所述，通过本研究证实PCI患者早期外周血中存在自噬的过度激活，但是否调控自噬能改善PCI患者的预后，需要进一步的基础和临床试验加以验证。