胡嗣钦，王兵，陈林，肖平

（1.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023；2.南宁市中医医院，广西 南宁 530001）

0 引言

创伤是40 岁以下人群最主要的死亡原因之一，全球每年约有10%的死亡病例和16%的伤残病例由床上导致[1]。严重创伤后，患者体内的有效循环血量减少，导致组织灌溉不足，细胞代谢紊乱，最终损害包括肝脏在内的多种器官，严重影响了患者的生存。参附注射液的主要成分为人参皂苷和乌头类生物碱，近来来，相关实验研究表明，参附注射液通过改善血流动力学紊乱，直接或间接减轻器官功能的损害，减少白细胞嵌顿和激活、抑制炎症因子、减弱细胞的黏附和浸润等[2]。IKK-β 和TNF-α 是最常见的炎症因子之一，参与由细胞内各种的免疫反应。据此，通过对Wistar 大鼠构建创伤嗜血性休克模型，探究参附注射液的作用机制，为临床中治疗创伤后失血性休克提供重要研究思路。

1 实验材料

1.1.1 实验动物

SPF 级 Wistar 雄 性 大 鼠50 只，体 重 在180g-220g 左右，由长沙天勤生物技术有限公司提供（实验动物许可证SCXK（湘）2014-0011）。适应性饲养 1 周后随机分为5 组，每组10 只，每只动物进行随机编号。大鼠饲养于广西中医药大学第一附属医院分子实验中心，室内温度控制在23℃-25℃，相对湿度保持在45%-60%，适应性常规喂养一周后开始进行干预造模。

1.1.2 实验药物

参附注射液:10mL/支（雅安三九药业有限公司，国药准字Z51020664）；0.9%氯化钠注射液：250mL/瓶（广西裕源药业有限公司，国字准药H45020976）

1.1.3 实验试剂

总RNA 提取试剂盒（TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit）（code：RR9767，日 本 TaKaRa 公 司）；逆 转录试剂盒 （PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time））（code：RR047A，日 本 TaKaRa 公 司）；荧光定量 PCR 反应试剂盒 SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNase HPlus）（code：RR820A，日 本TaKaRa 公 司)；大 鼠ELISA Kit 试剂盒（code：JYM0729Ra、JYM0646Ra，武汉基因美生物科技有限公司）

1.1.4 实验仪器

台式高速冷冻离心机Centrifuge 5810R；全自动染色仪器DAKEWE； 病理石蜡包埋机TMA81010100；倒置显微 镜CKX41；PCR 扩 增 仪TaKaRa TP-600 型；荧 光 定 量PCR 仪ABI-7500；紫外分光光度计岛津2000；超低温冰箱EXF40086V；超净工作台SW-CJ-IFD；

1.2 实验方法

1.2.1 造模及干预方法

将50 只SPF 级Wistar 雄性大鼠随机分为5 组，每组10只，即正常组（N 组）、模型组（M 组）、参附注射液低剂量组（D组）、参附注射液低剂量组（Z 组）、参附注射液低剂量组（G组）。适应性喂养一周后，N 组予常规饲养；

M 组、D 组、Z 组、G 组大鼠经3% 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（1mL/kg）后置于37%恒温操作台，折断双侧股骨中段。分离大鼠股动脉及股静脉，股动脉置管连接压力监测仪监测血压；同时，使放血和输液稳定血压水平。手术完毕稳定10min 开始放血，10min 内使大鼠平均动脉压维持在40mmHg（1mmHg=0.133 kPa）左右。随后M 组、D 组、Z 组、G 组于造模后0h、2h 进行2 次药物干预，分别予10mL/kg 生理盐水、5mL/kg 参附注射液、10mL/kg 参附注射液、20mL/kg参附注射液。

1.2.2 标本的采集

药物干预2h（造模4h），用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（1mL/kg）麻醉后，剪取大鼠剑突下腹白线正中横行2cm 作用手术切口，找到肝脏，剪取大小约为0.5cm×0.5cm×0.5cm肝脏组织2 块存放于液氮罐中备用以行ELISA 和 RT-PCR检测。

1.3 观察指标

1.3.1 肝脏ELISA 检测

根据ELISA 试剂盒说明书，将肝脏研磨均浆后，离心20分钟（每分钟转速：3500 转/分，离心半径：9.5cm）。在酶标包被板上稀释与加样，加酶。温育弃液后，加入洗涤液，静置30秒弃去，重复5 次。分别加入显色液A 和B。ELISA 检测仪以空白孔调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）来测定IKK-β、TNF-α 蛋白的表达。

1.3.2 肝脏组织PCR 检测

按试剂盒说明书提取大鼠总 RNA，紫外可见分光光度计测试提取液浓度后在普通梯度仪上逆转录成 cDNA，-20℃保存备用。RT-PCR 仪系统检测转运蛋白基因 mRNA 表达量。引物参照NCBI 中的基因序列设计，由生工生物股份有限公司代替合成IKK-β、TNF-α 及内参基因β-actin，包含2 个外显子的序列。合成引物见表 1。

表1 PCR 引物

1.4 统计学分析

采用 SPSS 22.0 软件进行统计分析，蛋白和mRNA 表达量为计量资料，计量资料采用均数±标准差（±s）的形式表示；多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD检测，组间比较采用卡方检验，以P≤0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 IKK-β、TNF-α 蛋白ELISA 检测结果

对ELISA 吸光度进行统计分析（表2），5 组大鼠IKK-β、TNF-α 蛋白水平表达总体差异有统计学意义（P<0.01）；与正常组相比较，模型组和三种参附注射液组的IKK-β、TNF-α蛋白表达差异均有统计学意义（★★P<0.01），与模型组相比较，三种参附注射液组的IKK-β、TNF-α 蛋白表达差异均有统计学意义（▲▲P<0.01）。

表2 血清中IKK-β、TNF-α 蛋白的表达量统计（±s）

表2 血清中IKK-β、TNF-α 蛋白的表达量统计（±s）

注：与N 组相比较，★★P<0.01；与M 组相比较，▲▲P<0.01；

分组 IKK-β TNF-α N 52.11±1.51 23.72±0.52 M 85.42±2.45★★ 68.41±0.87★★68.22±0.41★★▲▲ 57.43±1.21★★▲▲Z 63.01±0.56★★▲▲ 45.71±1.33★★▲▲G 59.86±1.23★★▲▲ 31.02±1.58★★▲▲P 值 <0.001 <0.001 D

2.2 IKK-β、TNF-α mRNA 水平RT-PCR 检测结果

检 测 各 组 大 鼠IKK-β、TNF-α mRNA 水 平（表3），采用与内参基因 β-actin mRNA 对比 2-△△Ct法统计。5 组大 鼠IKK-β、TNF-α mRNA 表 达 总 体 差 异 有 统 计 学 意义（P<0.01）；与正常组相比较，模型组和对照组的IKK-β、TNF-α mRNA 表达差异均明显增高（★★P<0.01）；与模型组相比较，对照组和实验组的IL-6、IL-8、TNF-α 和NF-κB mRNA 表达差异均有统计学意义（▲▲P<0.01）；与对照组相比较，实验组的ⅡKK-β、TNF-α mRNA 达差异均有统计学意义(☆☆P<0.01)；

表3 各组大鼠转运蛋白 mRNA 表达量统计（±s）

表3 各组大鼠转运蛋白 mRNA 表达量统计（±s）

注：与N 组相比较，★★P<0.01；与M 组相比较，▲▲P<0.01；

分组 IKK-β TNF-α N 1.00±0.25 1.00±0.18 M 1.78±0.37★★ 1.58±0.37★★1.54±0.45★★▲▲ 1.41±0.86★★▲▲Z 1.32±0.27★★▲▲ 1.32±0.21★★▲▲G 1.12±0.57★★▲▲ 1.21±0.25★★▲▲P 值 <0.001 <0.001 D

3 讨论

创伤失血性休克患者会出现明显的血流动力学异常，当有效循环血量减少，导致组织灌溉不足，细胞代谢紊乱，多种细胞因子、黏附分子表达或释放从而导致肠黏膜屏障受损，内毒素通过门静脉入肝，最终形成肝脏的衰竭[3-4]。肝脏枯否氏细胞(KC)是细胞因子和炎症介质的主要来源，通过NF-kb 信号通路能分泌TNF-α 等细胞因子参与全身及肝脏局部的炎症反应，在失血性休克继发的肝脏局部和全身的组织损害中扮演重要角色[5-6]。IKK-β 作为NF-kb 信号通路启动因子之一，是 NF-KB 的活化和移位的前提。所以在失血性休克后，与正常组相比较，模型组和对照组的IKK-β、TNF-α mRNA表达差异均明显增高，这是由于休克导致内毒素释放IKK-β，激活NF-kb 信号通路能分泌TNF-α。

参附注射液源于《济生方》中的参附汤，有回阳救逆、益气固脱的作用，是现代制药工业从红参和黑附片中提取其有效成分人参皂苷和乌头类生物碱而成。药理学研究表明，人参皂苷可以扩张管状动脉，降低心肌耗氧量，有减轻心肌缺血，改善微循环，稳定血流动力学的作用[7]；乌头类生物碱能兴奋α、β 受体，增强心肌收缩力，提高心输出量[8]。研究表明，参附注射液对血流动力学有明显的改善作用，能够有效的缓解血管内皮损伤，缓解高凝状态，促进休克后期凝血功能的恢复[9]。本研究结果显示,与模型组相比较，三组参附注射液的IKK-β、TNF-α 蛋白和mRNA 水平基因表达量均显著下降。与正常组相比较，高浓度的参附注射液组的IKK-β、TNF-α蛋白表达量和mRNA 水平差异无统计学意义。正因为炎症因子释放的降低，改变了肝细胞内环境，使肝细胞病理状态趋于正常肝细胞的状态。因此，我们可以推断测参附注射液通过抑制IKK-β、TNF-α 等炎症因子的表达，缓解血管内皮损伤，缓解高凝状态，从而改善和保护肝脏功能的完整性。

综上所述，参附注射液通过调控炎症因子的释放，缓解血管内皮损伤，从而改善和保护肝脏功能在创伤失血性休克中功能和形态的完整性。