李胜，费安兴，李颖，谢芳，江鸿通信作者)

（鄂东医疗集团黄石市妇幼保健院/湖北理工学院附属妇幼保健院（儿童医院），湖北 黄石 435000）

0 引言

儿童孤独症谱系障碍由多种致病基因导致，通过全基因组检测方法应用于孤独症患儿的临床检测，结果发现25 ～35%的遗传因素与孤独症发病密切相关，基因-环境共同影响孤独症临床表现。单核苷酸多态性(SNPs)可能会增加罹患复杂多基因疾病的风险。NRXN1 基因编码的突触细胞粘附分子是神经系统重要的功能蛋白，参与了突触基因转录翻译通路、泛素化通路、蛋白质合成和降解，影响神经元的发育、形成和功能。MECP2 基因编码的MeCP2 蛋白是一种转录因子，也调控神经元中许多基因的表达。虽然已经了解NRXN1 基因和MECP2 基因在神经系统中具有重要功能，但在孤独症谱系障碍疾病中的分子诊断尚未开展。本研究过检测NRXN1基因和MECP2 基因SNP 位点多态性与自闭症临床表现关联分析，建立孤独症谱系障碍的诊断方法。

1 资料与方法

1.1 受试者招募

受试者包括确诊为孤独症谱系障碍儿童及正常健康组儿童，所有确诊孤独症患儿均符合ASD 诊断指南[1]，为2019 年7 月至2020 年7 月在我院就诊的患者，受试者不区分男女性别。对照组受试者同样被告知该研究的目的、意义，获取血液样本的流程等，在获取患者同意后签署知情同意。

1.2 血样的获取及运输

患者签署知情同意书后，由主管医生同负责护士联系，在患者抽血用于血常规、血生化等检验项目时，多获取2mL 静脉全血用于抽提DNA 及后续研究。抽取该2mL 血样时使用含EDTA 抗凝的紫色帽采血管，轻摇混匀并记录患者住院号等相关信息以资鉴别。血样釆集成功后，尽快(6h 内)置于-20℃冰箱冷冻保存。定期由相关人员将冻存血样送实验室进行深低温(-80°C) 保存或DNA 提取，运输途中使用干冰或干冰袋保持低温，以防止血样因温度变化造成反复冻融而影响DNA 质量。

1.3 DNA 抽提、定量和纯度测定

DNA 提取采用TIANamp Blood DNA Kit 血液基因组DNA 提取试剂盒(离心柱型，目录号:DP318-02)，由天根生化科技(北京)有限公司生产。具体步骤如下：（1）取血液标本5-10mL，3000rpm 离心15min，小心丢弃上清，保留沉淀。（2）向沉淀物中，加入180μL 的缓冲液GA，重新彻底悬起。（3）加入200μL 蛋白酶K 溶液，轻轻颠倒混匀，56℃孵育10min。（4）加入200μL 的缓冲液GB，轻轻颠倒混匀，70℃孵育10min，至溶液彻底澄清，瞬离。（5）加入200μL的无水乙醇轻轻颠倒混匀样本，室温放置5min，瞬离。（1）取上一步所得溶液添加到一个吸附柱CR 中（吸附柱放入收集管中），12000rpm 离心30s，弃废液，将吸附柱CR 放回收集管中。（7）向吸附柱CR 中加入500μL 缓冲液GD（使用前请先检查是否加入无水乙醇），12000rpm 离心30s，弃废液，将吸附柱CR 放回收集管中。（8）向吸附柱CR 中加入700μL漂洗液PW（使用前请先检查是否加入无水乙醇），12000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱CR 放回收集管中。（9）向吸附柱CR 中加入500μL 漂洗液PW，12000rpm 离心30s，弃废液。（10）将吸附柱CR 放回废液收集管中，12000rpm 离心2-5min，尽量除去漂洗液。（11）将吸附柱CR 转入一个干净的离心管中，加入50μL 洗脱缓冲液TB，室温静置2-5min，12000rpm 离心2min 收集DNA。使用ABI 公司Qubit 3.0 荧光光度计检测DNA 浓度，DNA 浓度测定按照199:1 配置稀释液，将稀释好的DNA 溶液上机检测。

1.4 引物设计和PCR 检测

分别设计NRXN1 基因的1 条引物、MECP2 基因的2 条引物，采用血液基因组模板进行PCR 和电泳，PCR 扩增程序为：95℃，10min；95℃，15s，60℃，30s，72℃，30s;72℃，15min，35 个循环；4℃，终止。

1.5 数据分析

基因检索使用NCBI 基因检索数据库；引物设计采用NCBI-Blast 比对，使用Primer 软件进行引物在线设计。

2 结果

2.1 引物设计

根 据NCBI 上NRXN1 基 因 和MECP2 基 因 序 列 号分 别 是NM_001135659.3 和NM_001110792.2, 结 合 引物设计原则考虑GC 含量，碱基互补和退火温度等条件，设 计 一 条NRXN1 基 因 引 物 为：Forwardprimer:5’-ATGACAGAAGAAGCAGGCCT-3’，Reverseprimer:5’-AAGTACAGGAAGCCAGCAGT-3’;MECP2 基 因2 条 引 物分别 为：Forwardprimer:5’-ATGATGCTCTTTCCCACCCA-3’，R e v e r s e p r i m e r:5’-C C T T T T G C A C T C C A C T G T C C-3’;Forwardprimer:5’-TTGTTTCTCCCGTGCTTGTG-3’，Reverseprimer:5’-AACACACTCGGACCCTACTG-3’。

2.2 PCR 扩增测序分析结果

将PCR 扩增产物进行Sanger 测序分析，测序结果经比对分析结果显示，如图1 所示，分别是1 条NRXN1 基因的特异性片段，和2 条MECP2 基因特异性片段。由此说明，设计得到的1 条NRXN1 基因引物和2 条MECP2 基因引物均具有特异性，可用于PCR 检测。

图1 NRXN1 基因（A）和MECP2 基因（B 和C）PCR 扩增基因片段同源性比对分析结果

3 讨论

自闭症谱系障碍(ASD)是一组异质性的神经发育障碍，其特征是社会交往和沟通方面的问题以及重复和刻板行为的存在[2]。据估计，ASD 在普通人群中的患病率为1%-2%，平均男女比例为4-5:1。虽然ASD 具有复杂的多因素病因学，但双胞胎研究证实了其强大的遗传作用。单卵双生儿孤独症的符合率为70%-90%，双卵双生儿孤独症的符合率高达30%，在兄弟姐妹中占3%-19%。此外，同父同母兄弟姐妹之间的一致性比同父异母兄弟姐妹之间的一致性高两倍，这为遗传因素在ASD 的发展中起重要作用提供了证据[3]。多项研究证实了罕见的新生拷贝数变异(CNVs)对自闭症谱系障碍(ASD)风险的影响[4]。此外，约31%的ASD 患者还存在智力障碍(ID)，20%-37%的人患有癫痫，此外，癫痫性脑电图异常往往可在自闭症儿童中发现，即使没有癫痫发作，患有ASD 的儿童经常出现其他精神和医疗状况，包括焦虑症、抑郁症、注意力缺陷多动障碍(ADHD)、睡眠障碍和胃肠问题。约75%的ASD 患者被诊断为原发性自闭症谱系障碍，这种类型ASD 的患病率约为35%的兄弟姐妹和约20%的病例有ASD 阳性家族史[5]。

研究表明，一些重要候选基因是影响ASD 症状的关键因子[6]。基因位点突变和CNVs 提示这些基因编码的蛋白在染色质重构(CHD8, BAF155)、突触细胞粘附分子(Neurexin 和Neuroligin 家族，CNTN4)、神经递质、突触支架蛋白(SHANK2和SHANK3)、离子通道蛋白(CACNA1A, CACNA1H, SCN1A,SCN2A)发挥重要作用。这些蛋白还参与与突触基因转录翻译通路(FMR1、TSC1、TSC2、PTEN、NF1、CYF1P1)、泛素化通路(UBE3A、PARK2、TRIM33)、蛋白质合成和降解相关的信号通路和神经元网络，参与突触和神经元的发育、形成和功能[7-9]。染色质重构调控基因表达，可能影响神经元的形成和分化。MeCP2 蛋白(甲基CPG 结合蛋白2)是一种转录因子，调控神经元中许多基因的表达[10]。本研究通过NRXN1 基因和MECP2基因引物设计，在前期入组的孤独症确诊患儿血液基因组进行PCR 扩增，结果显示，我们所设计的三条引物均具有特异性，可以应用于PCR 检测；通过NRXN1 基因和MECP2 基因PCR 扩增特异性引物设计，为进一步进行基因位点SNP 测序与自闭症临床表现关联分析具有重要意义，也具有良好的应用前景。