程筱，杨芳

（江苏省生物材料与器件重点实验室 东南大学生物科学与医学工程学院，江苏 南京 210009）

0 引言

在过去的20 年中，突发性脑卒中、由脑卒中引起的伤残调整生命年（DALYs，disability-adjusted life-years）及脑卒中相关的死亡率在世界范围内仍体现为持续增长[1]，这一形势在发展中国家表现得更为严峻。数据显示，截止2017 年，脑卒中已成为全球第三大致残及致死原因，其中缺血性脑卒中占60%以上[1]。根据预期，在未来的相当一段时间内，脑卒中对发展中国家公共医疗事业造成的压力将持续增长[2]。而在有关急性缺血性脑卒中临床治疗的探究中，能否在治疗时间窗内有效抢救缺血半影，很大程度上决定了脑卒中发病后的临床生存率，并因此长期占据着此类研究的焦点。

缺血半影（ischemic penumbra，IP），即局部缺血后受损但尚未死亡（又定义为生理电活动停止但能保持跨膜离子平衡和结构完整或保持能量代谢而血供受限[3]）的脑组织区域。自1977 年半影的概念提出后[4]，缺血半影先后接受了在电生理、脑血流及代谢缺血调节层面、介导半影细胞死亡的分子机制层面与临床神经成像器材方面的广泛研究[5]，有关其治疗性抢救的理论可能性，意味着急性缺血性脑卒中临床诊疗更为光明的未来。简而言之，急性缺血性脑卒中病灶的中心区域通常由于严重供血障碍（或完全缺血）而引起脑细胞非程序性死亡，而侧支循环的存在使得缺血半影区仍能保持一定程度的血流供应。半影区域内，神经细胞功能受到抑制（部分伴有功能损伤），但在再灌注时间窗内仍保持存活并处于生理可逆状态，即恢复供血可重新整合代谢、维持系统神经功能正常运转。目前，应用于脑卒中临床诊断的技术中，仅正电子断层发射扫描（PET）可识别供血受限但仍存在一定代谢水平的脑组织、磁共振成像（MRI）可实现对缺血病灶区域受细胞毒性影响有限的区域的识别，即对缺血半影的诊断[6]。

PAMNs（Platelet membrane coated L-arginine and magnetic nanoparticles）是一种血小板膜仿生气体前体药物纳米递送系统[7]，其主要机制为利用血小板膜包被一氧化氮（NO）前体材料L-精氨酸与磁性纳米粒子，使其在血管环境中能够被血小板膜上的特异性粘附蛋白靶向至卒中病灶，并藉由内皮细胞中一氧化氮合成酶（eNOS）的作用产生信号分子NO，从而达到舒张血管与持续抑制卒中进一步形成的效果。磁性纳米粒子则作为可选择的外部磁场响应剂与MRIT2加权成像的造影增强成分，适用于在体研究中不同的诊断治疗需求。基于前述对于缺血半影的诊断需求，PAMNs 可作为一种理想的诊疗一体化材料应用于AIS 半影的诊断辅助与一定程度的应急治疗。事实上，PAMNs 在本研究中的确表现出了不俗的对AIS 病灶边缘的显影增强效果。

本文基于PAMNs 材料在MRI 诊断缺血半影中的造影增强与治疗时间窗内的治疗效果进行了在体表征与讨论，期望可为后续针对急性缺血性脑卒中临床诊疗的研究与试验提供部分佐证与启发。

1 实验方法

1.1 PAMNs 材料的制备与形貌表征

PAMNs 主要通过挤压过膜法（使得血小板膜、精氨酸与磁性Fe2O3 纳米粒子的混合溶液受压以通过一定孔径的纳米薄膜）制得。本实验所用材料的制备流程简述如下：

将采集的新鲜单采血小板置于4℃，4000 g 离心、弃上清液并使用生理盐水重悬，重复3 次以去除细胞器，获得纯净的血小板膜（nPLT）溶液；

取1mg/mL nPLT 溶 液，以50mmol/L 加 入L- 精 氨 酸（Mw=174.2g/mol）、100μg/mL 加入Fe2O3 纳米粒子，所得混合溶液置于水浴超声10 min 充分混匀；

将混合溶液转移至脂质挤出器内，密封加压使其通过800 nm 滤膜以形成囊泡结构，重复10 次，可制得本实验所用PAMNs 材料。

材料的水动力尺寸、电位特性由Nanosight 纳米颗粒跟踪分析仪（NS300，英国Malvern 公司）采集，其内部结构通过透射电子显微镜（JEM 2100，日本JEOL 公司）与扫描电子显微镜（Ultra Plus，德国Carl Zeiss 公司）进行表征。

1.2 光化学栓塞致脑卒中小鼠模型的制备

所有动物实验均根据东南大学机构动物护理和使用委员会制定的动物护理和使用指南进行，该方案经东南大学医学院动物实验伦理委员会批准。

本实验利用在小鼠脑皮层区域形成光化学栓塞以模拟急性缺血性脑卒中模型[8]。其具体制备操作简述如下：

选取6-8 周的SPF 级雄性C57BL/6 小鼠（上海西普尔-必凯实验动物有限公司），控制体重在20g 左右，以10μL/g体重经由腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉剂；

确认小鼠进入深度麻醉状态后，以10μL/g 体重经由尾静脉注射1%玫瑰红溶液；

去除小鼠颅顶毛发并对该区域进行消毒，以俯卧位固定在手术台上，剪开区域皮肤以充分暴露前卤，使得直径为4 mm 的冷光源束垂直照射在其前卤右下方约2 mm 的头骨上，调节光强至36，照射15 min 以形成光化学栓塞，制得急性缺血性脑卒中小鼠模型。

图1 光化学栓塞脑卒中模型造模示意

1.3 PAMNs 动物模型体内磁共振参数选择

前述急性缺血性脑卒中模型用于后续研究时，药物（PAMNs 与生理盐水）均通过尾静脉进行注射，其造影增强与治疗效果则通过磁共振T2 加权成像与T2*加权成像进行评价。实验操作简述如下：

将模型小鼠以俯卧位固定于小动物磁共振成像系统（Biospec 7T/20 USR，德国Bruker 公司）的动物轨道中，通入体积分数位1.5%的异氟烷气体麻醉剂以麻醉小鼠，加热轨道使得小鼠体温维持在如上37℃，并通过心率监测系统实时确认模型的生命活动水平；

设置实验所用TurboRARE-T2 序列的扫描参数为重复时间TR=3000.0 ms，回波时间TE=36 ms，平均数number of average=8，回波链长度echo train length=8，翻转角flip angle=135.0°，扫 描 矩 阵尺寸为256×256，切 片 厚 度slice thickness=1mm，视场FOV=20mm×20mm；

设置实验所用Flash-T2* 序列的扫描参数为重复时间TR=300.0 ms，回波时间TE=7.5 ms，回波链长度echo train length=1，翻 转 角flip angle=70.0°，切 片 厚 度slice thickness=0.7 mm；

将急性缺血性脑卒中小鼠模型随机分为实验组与对照组（n=3）。通过尾静脉分别向每只实验组小鼠注射200μLPAMNs 材料，向每只对照组小鼠注射200μL 生理盐水，以前述参数采集其注射前及注射后0.5、1、2、3、4、6 h 时的脑部区域图像。

采集所得MRI 数据的灰度统计分析与T2 影像所表现的病灶面积统计均采用ImageJ v1.52a 进行测量。

2 实验结果与分析

2.1 PAMNs 材料的制备与形貌表征

本实验制备PAMNs 的水动力直径为（111.33±9.24）nm，ζ 电位为（-12.93±1.20）mV。图2 的SEM 和TEM 结构表征可见，制备所得PAMNs 的表面较为光滑，结构呈稳定的微球形。

图2 PAMNs 形貌照片。a) TEM 与b) SEM 下的PAMN

2.2 PAMNs 材料在磁共振成像中对缺血半影的造影增强

PAMNs 材料内包含的γ-Fe2O3 纳米粒子本身具有一定的磁共振T2 与T2*加权成像的造影增强性能，其表面包覆的血小板膜纳米层又使得材料在脑卒中病灶区域产生了较强的靶向富集性，此两方面的作用在图3 所示的对比时间序列中都明显可见（T2 影像初始病灶以黄色箭头标出，T2*影像初始病灶以红色箭头标出）。

图3 PAMNs 在MRIT2 与T2＊加权成像中的造影增强

此外，相比于注射有同剂量生理盐水的对照组，注射有PAMNs 材料的小鼠脑卒中区域的边缘在两种成像模式下都产生了显著的灰度降低，表明PAMNs 材料在病灶边缘区域的富集，这可能来源于脑卒中病灶坏死核心对PAMNs 递送产生的阻碍。由于主要血管的栓塞，材料难以通过血流递送作用抵达病灶深层区域，从而在保留有完整形态与一定微血流供给的缺血半影区域形成了低灰度、高对比度的环形PAMNs富集层，使得“存在急救价值的”缺血半影能够在MRI T2 与T2*序列扫描中被特异性显影增强。这一效应在较为严重的梗死灶中体现得更为明显。

实验结果显示，在相同的成像条件下，T2 加权影像表现出更为清晰的病灶形态，而T2* 加权影像则表现出相对更高的对比度，即更为显著的缺血半影造影增强效果。两种成像模式下，缺血半影与其周边组织的对比效果随时间发展、PAMNs 在病灶周边的富集进一步增强；与此同时，PAMNs 对AIS 病灶的治疗效果则引起了一部分轻微栓塞血管的再灌注，随着材料伴随再灌注血流的迁移，半影环形区域直径不断缩小并逐渐被递送至病灶的更深层区域。在这种情况下，本实验认为PAMNs 对AIS 缺血半影的造影增强效果是确实有效的，且这种特异性增强行为随着时间与病灶的发展仍能够得到保证，即是说：

PAMNs 可基于MRI 手段实现对AIS 半影发展的实时监控，有利于AIS 的临床特异性诊断与其后治疗策略的制定，并体现出一定的治疗效果（在随后2.3 部分表征）。

2.3 PAMNs 对AIS 的预应急治疗评价

由MRIT2 影像体现、以PAMNs 富集环状区域为边缘的急性缺血性脑卒中的病灶面积发展统计如图4 所示。为最大限度减小模型个体差异所造成的误差，此处采用病灶面积发展比例来衡量病灶的相对增长趋势，定义为：Lesion area development=lesion area (t)/lesion area (t=t0)。

图4 病灶面积发展统计

由统计图可见，相对于对照组，注射有PAMNs 材料的模型鼠AIS 病灶发展无论在栓塞刚发生的0.5 h 内还是在后续的完整治疗时间窗6 h 中都表现出了显著的发展抑制效应。在病灶形成的0.5 h 内，可能由于轻微栓塞集中在外部缺血半影区域，保存有相对较大的治疗余地，对照组的病灶发展十分迅猛，而PAMNs 抑制作用的集中大量特性在此期间得以体现；在病灶形成的1-6 h 内，可能由于递送通路、生理电活动与功能受限，PAMNs 无法发挥理想条件下的治疗作用，病灶核心区域的再灌注表现相对受到了制约。此外，对照模型的自愈水平也是需要考虑的因素之一。

综上所述，PAMNs 可经由缺血半影区域的血流再灌注实现治疗时间窗内对AIS 病灶发展的动态性有效抑制，这进一步体现了PAMNs 材料在AIS 缺血半影造影辅助方面的优势，其应用于MRI 的诊疗一体化作用也得到了保障。

3 结论

本论文通过建立光化学栓塞致急性缺血性脑卒中小鼠模型，通过PAMNs 材料应用于该动物模型，进行MRI 诊疗一体化的在体表征，本实验证实了一种血小板仿生气体前体药物纳米递送系统：PAMNs 对缺血半影的造影增强效果与结合于病灶实时承疗水平（血流再灌注）的AIS 发展动态抑制作用。在此基础上，本结论对广泛的缺血半影研究而言，将可能作为参考或引起更多有关纳米药物递送系统、缺血半影造影增强、MRI 及其他成像技术用于缺血半影诊断等方面的思考，由此，未来有关脑卒中临床诊疗策略将可能存在更多选择。