赵阳，邓秀玲，武瑞兵，王海生

(内蒙古医科大学基础医学院，内蒙古 呼和浩特 010110）

0 引言

胃癌是消化系统中最常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内，胃癌的发病率和死亡率在癌症中排名第二[1]。半数以上的发患者群集中在东南亚地区，这些国家的死亡率高于其他国家[2]。目前对于早期胃癌患者行根治性治疗即手术后进行化疗，术后随访5 年生存率90%[3-4]。胃癌的发病机制是一种多步骤、多因素的综合性疾病。

低密度脂蛋白受体相关蛋白-5(LRP-5 蛋白)是低密度脂蛋白受体家族中的一员，在许多组织中高表达，参与调节骨发育，胆固醇代谢以及肿瘤的发生发展[5-7]。LRP-5 属于单次跨膜结构的受体蛋白,对Wnt 信号转导至关重要。Wnt 蛋白通过与卷曲蛋白(Fz)家族的7 个跨膜受体以及低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP) 5 和6 的成员结合，启动信号转导[8-10]。前期已有研究证实LRP-5 与胃癌的发生发展相关，本研究利用蛋白质组学的方法对其作用机制及靶点进行预测，旨为之后LRP-5 抗胃癌分子机制的深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

转染无关序列细胞、转染LRP-5 基因sh'RNA 质粒来自内蒙古农业大学实验室。过硫酸铵购自sigma 公司。IPG Buffer pH3-10 NL、ImmobilineTM DryStrip 购 自GE 公司。非干扰型蛋白质浓度测定试剂盒（SK3071）、溴酚蓝、2D Equilibration Buffer（SD6030）、2D 电泳样品提取缓冲液系列、琼脂糖封胶液（0.5%低熔点琼脂糖+电泳缓冲液）均购自上海生工公司。乙腈和基质α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）、乙腈（ACN）购自Gibco 公司。台式高速离心机购自上海医疗器械有限公司

1.2 各细胞总蛋白质的提取

1.2.1 样品制备

收集两组处理过的胃癌MGC-803 细胞，分别加入含PMSF 的RIPA 裂解液，充分混合均匀。在80-100W、2S 下超声3min,之后在 4℃、12000rpm 的离心机离心30min。收集上清到EP 管中，将适量提前遇冷的丙酮加入含上清的EP 管中，-20℃过夜，次日离心30min，弃上清，在沉淀中加入一定量PL039 蛋白裂解液。

1.2.2 蛋白质定量

取12 只1.5mLEP 管，将不同梯度体积的蛋白质标准品加入EP 管，重复两次，在每个EP 管中加入0.5mL 沉淀剂I, 涡旋30S，静置2-3min, 之后加入0.5mL 沉淀剂Ⅱ，涡旋30s,12000rpm 离心5min, 弃上清，加入100ul 铜试剂、400ul ddH2O，涡旋30S，之后加入1mL 生色试剂混合液，常温下静置15-20min，480nm 波长下测量OD 值，根据标准曲线计算蛋白质含量。

1.3 蛋白质双向电泳

1.3.1 等电点聚焦电泳（第一向）

蛋白上样量为 150μg，选用pH3-10 NL IPG 预制干胶条，进行第一向等电聚焦电泳，电泳参数及条件如下：（表 1）。

表1 等电点聚焦电泳参数

将聚焦的胶条加入10mL 的2D 平衡缓冲液（加入1%二硫苏糖醇），摇15min。之后加入2D 平衡缓冲液（2.5%碘乙酰胺）清洗，摇15min。

1.3.2 SDS-PAGE（第二方向）

胶条置于凝胶板中并加入低熔点琼脂糖封胶液。室温放置20min 后开始电泳，电泳45min，200V /胶，当溴酚蓝移动到距离凝胶下沿0.5cm 取出凝胶进行染色。

1.3.3 凝胶染色

凝胶固定2h，用考马斯亮蓝染色12h，之后水洗染料。

1.3.4 凝胶图扫描

以300dpi 的分辨率扫描漂洗的PAGE 凝胶。使用PDquest 8.0 软件分析图像。

1.4 蛋白质质谱鉴定

1.4.1 脱色冷冻

将颗粒切碎置于EP 管中。添加200-400μL 乙腈使管中颗粒脱色。冷冻干燥，加入5μL 测序级胰蛋白酶溶液，37℃下反应约20h。吸出酶水解产物并转移到新的EP 管中进行冻干。

1.4.2 MALDI-TOF-TOF

取冻干样品2μL，加入乙腈重新配制样品，取1μL 样品加到样品靶上，自然风干。将0.5μL 过饱和CHCA 基质溶液点到相应的目标位置，自然干燥，样品靶用氮气吹扫，放入仪器进靶槽。质谱分析采用自动采集数据模式和正离子采集数据，PMF 质量扫描范围为800～4000Da，之后选用母离子信噪比大于50 的离子进行二次质谱分析。

1.4.3 数据库选择

该试验检索了Mascot 数据库，该蛋白质鉴定检索软件使用广泛，能将质谱数据识别为蛋白质。

1.5 观察指标

用双向电泳及差异点软件分析两组蛋白质差异点，蛋白质质谱对部分差异点进行质谱鉴定。

2 结果

2.1 蛋白质定量(图1)

图1 蛋白质定量标准曲线

两组实验样品蛋白质测定的浓度分别为：L68：10.83μg/μL；NC：11.88μg/μl。

2.2 2D 电泳实验结果

由左到右为等点聚焦电泳，由下到上为 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱（图2）。

图2 蛋白质2D 电泳

2.3 差异点分析

利用 PDQuest 软件分析2D 电泳胶图，寻找蛋白表达差异点。结果如图3：

图3 各实验组蛋白质差异点

经过双向电泳和PDQuest 软件分析，发现实验组与阴性对照组组两组间蛋白质灰度值大于2 倍以上的一共有 29个点，在这项研究中，采取了15 种蛋白质差异点进行质谱分析。

2.4 蛋白质质谱鉴定

通过灰度值差异进行选择，在29 个灰度值差异大于2 倍的蛋白质点中，选择15 个点进行质谱鉴定，12 个成功。与无关序列组相比，干扰组中10 个点上调，2 个点下调。这些蛋白质包括：细胞骨架，细胞周期，分子伴侣，细胞增殖和糖代谢相关蛋白。如表2：

表2 经 MALDI-TOF-TOF 鉴定的 12 个差异蛋白质点

3 讨论

已有文献报道LRP-5 蛋白含量在胃癌组织中明显高于其他正常组织，通过基因沉默其表达可抑制胃癌MGC-803 细胞的侵袭和迁移能力。前期多集中在对单个蛋白表达的研究，对于LRP-5 相关的所有蛋白表达情况尚不清楚。

本研究从蛋白质组的角度出发，研究沉默LRP-5 蛋白后胃癌MGC-803 细胞中整体蛋白质的变化情况。本研究采用双向电泳对蛋白质进行分离，蛋白质谱对其分析鉴定，研究发现共有15 个差异蛋白点，成功鉴定12 个，其中表达量上调的蛋白10 个，下调的蛋白2 个。上调的蛋白包括FSCN1、EZRI、EF2、TRAP1、HSP90α、NPM、DJB11、TRXR1、GAPD、ATPA，下调的蛋白包括PGK1，NDKB。

筛选出的蛋白质主要在葡萄糖代谢、细胞侵袭迁移、细胞周期等方面发挥作用。硫氧还蛋白还原酶(TrxR)是Trx 系统的重要组成部分，在调节多种细胞氧化还原信号通路中起着关键作用[11]。雷洪等研究发现人硫氧还蛋白还原酶（TrxR）促进活性氧(ROS)的产生从而抑制肝癌细胞的生长并诱导凋亡，并伴随丝裂原相关蛋白激酶通路的激活[12]。许多肿瘤细胞的TrxR 水平升高[13-14]。李楠等[15]研究发现Ezrin 蛋白在乳腺癌组织中表达上调，其在体内外均能促进乳腺癌的增殖、迁移、侵袭和血管生成。

综上所述，以上两种蛋白与肿瘤的发生发展有密切关系，因此本研究以LRP-5 作为切入点，筛选出的12 个蛋白点可用作调节胃癌发生发展的靶点，本研究采用的细胞种类单一，对差异的蛋白未进行进一步证实，通过本研究初步探索的作用靶点为治疗胃癌的发生发展提供新的思路和理论基础。