焦雪娟通信作者，余文华

(蚌埠医学院第一附属医院妇产科，安徽 蚌埠 233000)

0 引言

稽留流产，可称之为过期流产，其含义为胎儿在死亡一段时间内不能被正常排出体外，仍然滞留在宫腔内。引发稽留流产的因素有很多，其发病率也极高，其中包括的因素有遗传基因异常、生殖器官有异、生殖器官感染、内分泌失调以及外界环境因素，另外还有大约60%-70%的个体其患病原因尚不明确。子宫内膜细胞外基质的关键组成成份包括层粘连蛋白、纤连蛋白、胶原，当胚胎植入以及受精卵着床的时候，则需要将其进行降解。关于调节子宫内膜细胞外基质上胶原的合成，则是由两组酶及其抑制因子进行，分别是基质金属蛋白酶和基质金属蛋白酶抑制因子,半胱氨酸组织蛋白酶和半胱氨酸组织蛋白酶抑制因子。

本研究拟搜集稽留流产妇女（16 例）和正常早孕妇女（21例）的绒毛组织，通过Western-blot 检测MMP-2（基质金属蛋白酶-2）和TIMP-2（基质金属蛋白酶组织抑制物-2）在绒毛组织中的表达，研究稽留流产与MMP-2 及TIMP-2 的相关性，进一步查找稽留流产的具体的病因，这给以后对稽留流产进行治本疗法提供了条件。

1 资料与方法

1.1 一般资料

时间跨度控制在2019 年11 月至2020 年11 月期间，选取在我院妇产科门诊就诊的稽留流产患者16 例，年龄24～44岁，停经时间42～85 天。选择同期就诊我院妇产科门诊要求终止妊娠的21 例正常早孕妇女作为正常对照组，年龄17～43岁，停经时间42～63 天。两组年龄、停经时间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。

1.2 入组标准

实验组个体标准：（1）个体确诊为稽留流产；（2）经胚胎染色体测试，夫妻皆无异常；（3）经白带及超声检查，个体无生殖器官异常和被感染现象；（4）男方精液无异；（5）个体体内抗体呈阴性，包括抗甲状腺球蛋白、抗核酸抗原、抗心磷脂这些抗体；另有停经史以及阴道无血或阴道有少量血的临床症状，宫内妊娠经彩超检测，呈无胚芽现象或者无心管搏动现象。对照组个体标准：正常妊娠但在怀孕12 周内进行人工流产的个体，无自然流产病史，此次妊娠阴道临床症状表现正常；胚胎经彩超检测为正常，呈有胚芽现象以及有心管搏动现象。

1.3 Western blot 检测MMP-2、TIMP-2 蛋白表达

无菌操作下收集人工流产时取出的绒毛，用PBS 漂洗去除血污后，通过冷PBS 进行流动性洗涤，将已经预冷过的细胞裂解液取出，对细胞进行裂解，最后把总蛋白提取出来，且实行蛋白定量，将总含量为25μL 的细胞总蛋白与上样缓冲液进行变性，而后通过10%聚丙烯酰胺凝胶来进行电泳分离，最后将其转移到硝酸纤维素膜中；把硝酸纤维素膜放在5%脱脂奶粉中，室内温度下密闭2h；另外将兔抗人MMP-2、TIMP-2 一抗（1:300）置于4°C 中过夜；已经添加了辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（1:1000）置于37°C 中2h，添入化学发光底物常规显影，将β-actin 作为内参照。

1.4 统计学处理

实验数据以均数±标准差表示，各组间比较采用t检验，P<0.05 确定为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组绒毛组织中MMP-2、TIMP-2 蛋白表达水平

与正常终止妊娠患者相比，患有稽留流产个体体内的MMP-2 蛋白表达水平以及TIMP-2 蛋白表达水平都显著下调（***P<0.01,**P<0.1）。见图（1-6）及表（1,2）。

2.2 实验结果

图1 MMP-2 和TIMP-2 在稽留流产患者绒毛组织中的表达

图2 MMP-2 和TIMP-2 在稽留流产患者绒毛组织中的表达

图3 MMP-2 和TIMP-2 在正常终止妊娠绒毛组织中的表达

图4 MMP-2 和TIMP-2 在正常终止妊娠绒毛组织中的表达

图5 MMP-2 和TIMP-2 在正常终止妊娠绒毛组织中的表达

图6 MMP-2 和TIMP-2 在不同患者绒毛组织中的表达量的差异

表1 MMP-2 t 检验

表2 TIMP-2 t 检验

3 讨论

基质金属蛋白酶（MMPs），其属于锌离子依赖性蛋白酶，一般情况下，都是呈非活性酶原状态而渗出细胞外的，现如今起码已经有18 种MMP 被发现了，它们共同组成了MMPs超家族，MMPs 超家族中最关键的MMP 之一是Ⅳ型胶原酶，其可由两个亚型组成，分别是MMP-2（72KD 型，明胶酶A）以及MMP-9（92KD 型明胶酶B），Ⅳ型胶原和弹力纤维是MMP-2 和MMP-9 的关键作用底物，另外还含有消融明胶的特点。基质金属蛋白酶抑制物(tiSSueinhibitorsofmet alloproteinases,TIMPs) 能够阻碍MMPs 进行活化。按照各类TIMPs 出现的时间次序进行定名，分别称之为TIMP-1，TIMP-2，还有TIMP-3 和TIMP-4，不管是活化的MMP-2 还是非活性的MMP-2，TIMP-2 都能够跟它进行联结，最终得到比例为1:1 的化学复合物，并且MMP-2 会因此没了活性，也就没了破坏胶原的能力[4,5]。在细胞外基质进行降解的时候，MMPs 与TIMP 之间所维持的动态平衡在其中有极大的影响。

不管是胚胎植入还是受精卵着床的时候，子宫内膜细胞外基质都需要被降解，此过程类似于恶性肿瘤的生物学行为，层粘连蛋白、纤连蛋白以及胶原共同组成了子宫内膜细胞外基质的关键部分。在滋养细胞达成掠夺的途中，子宫内膜细胞外基质(ExtraeellularMatrix，ECM)的降解在其中有着十分关键的调节作用。Niu[6]等研究结果显示：有活性的MMP-2在妊娠早期由绒毛组织泌出，随着胎盘的生长发育，在妊娠整个时期都会有TIMP-1,2 的存在。Xu[7]等报道表示：人滋养细胞会分泌出MMP-2,9 以及对MMP-2,9 进行调节，另外还会分泌以及调节组织抑制物TIMP-2,1，孕期达到6 周后滋养细胞就能够泌出MMP-2，孕期达7 周后MMP-9 水平会持续升高。蒋德菊等[8]研究显示，患有稽留流产个体体内的TIMP-1表达率增加，因此预测在稽留流产发病期间，MMP-9/TIMP-1的动态失衡对其有着极大的影响。

炎症对妊娠有极大的影响，胎膜提早被破以及早产风险提高的原因，跟细胞因子与基质金属蛋白酶(MMPs)之间出现动态失衡的情况息息相关[9]。MMP 能够由好几种细胞类型所形成。于正常个体组织里，运用免疫组织化学技术几乎检验不到MMP 的存在，不过当个体被损伤及个体怀孕时，其体内的蛋白质沉积会加多。MMP 能够将细胞外基质（ECM）中的好几类蛋白质进行降解，且经过分解基质中关键的支架大分子而踊跃参加重塑ECM 活动。MMP 与TIMP 共同维持动态平衡，以保证孕早期正常及胎盘发育顺利。明胶酶MMP-2和MMP-9 是尤其涉及成功细胞滋养细胞浸润在妊娠早期，因为它们是在基底膜，其主要由IV 型胶原蛋白的降解被认为关键酶[10]。MMP 的组织抑制剂（例如TIMP-1 和TIMP-2）调节蛋白酶的活性。胎儿滋养层细胞侵袭子宫内膜后，会对人胎盘实行介导作用。某种特定的蛋白水解酶的分泌可以对子宫内膜基底膜以及子宫内膜细胞外基质进行降解，而且这种酶的分泌能够精准调节滋养细胞的侵袭。在自然终止妊娠中，MMP-9 含量以及MMP-2/TIMP-2 复合物含量的增加对此也许存在影响[11-12]。

综上所述，MMP-2 和TIMP-2 在子宫内膜中的研究比较广泛，涉及了多种妇科疾病。经过研究得出，MMP-2 的表达水平以及TIMP-2 的表达水平在患有稽留流产个体的绒毛组织中处于明显性降低状态。另外MMP 和TIMP 都参与组织重塑，伴随着组织的快速生长和结构变化。由于妊娠是一个动态的环境，并且MMP 在整个妊娠过程中都对其持续重塑做出了贡献，因此有必要对该领域进行进一步的研究。

总而言之，可得出结论：也许在稽留流产的发生机制中，MMP-2/TIMP-2 的存在非常关键，不过对其在分子调控机制方面的详情未能明确，因此，我们将在未来的研究中探讨具体的分子调控通路。